в каплях (ddPCR) недавно стала мощным методом абсолютного количественного определения AAV. Этот метод может устранить необходимость в стандартной кривой и менее чувствителен к ингибиторам, происходящим из компонентов в составе (Pacouret et al., 2017). Общее содержание капсидов может иметь такое же значение, как и титр векторного генома, и на сегодняшний день не существует согласованного метода анализа общего количества капсидов или способности отличать пустые частицы от частиц, содержащих геном.Разделение частиц AAV и количественное определение соотношения полный / пустой может быть достигнуто с использованием таких методов, как иммуноферментный анализ (ELISA), электронная микроскопия, аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) и жидкостная хроматография высокого давления (HPLC), где каждый имеет свой собственный преимущества и ограничения (D’Costa et al., 2016; Dorange, Le Bec, 2018).

Целью нашего исследования было объединить два подхода к характеристике векторов AAV и собрать более общее представление о конкретных векторах AAV.Мы сравнили кПЦР и ддПЦР с использованием различных анализов и предварительной обработки, чтобы выявить преимущества и недостатки титрования вирусного генома. Мы также представили практический пример, показывающий незаменимость просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) для визуализации целостности капсида AAV и примесей в качестве дополнительного метода к молекулярным методам.

Материалы и методы

Материал AAV

векторов AAVrh.10, использованных в исследовании, состояли из капсидных белков резуса серотипа 10 и векторного генома, содержащего 5 ‘инвертированный концевой повтор AAV2 (ITR), сигнал упаковки AAV2 (C), энхансер CMV, промотор куриного β-актина. донор сплайсинга и интрон кроличьего β-глобина с акцептором сплайсинга, кДНК для трансгена, за которой следует сигнал полиA кроличьего β-глобина, и 3’-ITR AAV2.AAVrh.10 продуцировали в клетках HEK293T путем котрансфекции гибридной плазмиды упаковки-помощника AAVrh.10 pPAKMArh.10 и плазмиды экспрессии трансгена с использованием реагента для трансфекции PEIpro (трансфекция Polyplus, Франция). Клетки, экспрессирующие AAVrh.10, собирали на 3-й день после трансфекции.

Для этого исследования были использованы два разных вектора AAVrh.10. Для большинства экспериментов испытуемым был AAVrh.10hCLN2 (Sondhi et al., 2005), но для последующего тестирования очистки вектором был AAVrh.10мЧерри (Таблица 1).

Таблица 1. Список выполненных экспериментов с соответствующими испытуемыми, анализы, предварительные обработки, методы с количеством повторов и статистический анализ.

Очистка вируса

AAVrh.10hCLN2

AAVrh.10hCLN2 был очищен из сырого вирусного лизата с помощью йодиксанолового градиента и анионообменной хроматографии QHP (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси, США) (дополнительный рисунок 1 в дополнительном листе данных 2).Очищенные векторы концентрировали с использованием центробежных фильтровальных установок Amicon Ultra-15 MWCO 100 кДа (Millipore, Billerica, MA, United States) и хранили в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, при -80 ° C.

Частично очищенные образцы AAVrh.10mCherry

клеток HEK293T, трансфицированных для получения AAVrh. 10 мЧерри, ресуспендировали в буфере для лизиса, 20 мМ Трис, 2 мМ MgCl2, pH 8,0. Впоследствии материал был подвергнут пяти циклам замораживания-оттаивания. Замораживание производили в смеси сухой лед / 70% изопропанол и размораживали на водяной бане при 37 ° C (15 мин).Лизат осветляли на лабораторной центрифуге Sigma, 3K15 (Sigma Laborzentrifugen, DE, США) в течение 35 мин при 9384 g при 4 ° C. Клеточный дебрис осаждали и собирали супернатант. Осветленный лизат использовали для хроматографической разработки последующего процесса на монолитных колонках CIMmultus ^TM (BIA Separations, Словения). Монолит CIMmultus ^TM OH или колонку CIMmultus ^TM SO3 промывали водой и уравновешивали до 1.5 M калий-фосфатный буфер (KPB), pH 7,0. Лизат rAAV разбавляли калий-фосфатным буфером (2 M KPB, pH 7,0) до достижения целевой концентрации 1,5 M KPB. Образец загружали в колонку и элюировали линейным градиентом 50 мМ KPB pH 7.

Дизайн анализа

Четыре различных анализа были использованы для количественной оценки векторов AAV, используемых в исследовании, чтобы охватить весь геном и дать возможность оценить целостность инкапсидированного генома. Анализ КПЦР CMV был разработан, как описано ранее Belfer Gene Therapy Core Facility в Weill Cornell Medicine (BGTCF) (Таблица 2; De et al., 2018). Три других анализа, нацеленные на бета-актин, бета-глобин и полиА, были разработаны в Национальном институте биологии (NIB) (таблица 2). Они были разработаны с использованием программного обеспечения Primer Express 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США). В программе были выбраны дизайн зонда TaqMan и праймера с параметрами по умолчанию. Была вставлена ​​последовательность, покрывающая интересующую область, и программное обеспечение предложило несколько анализов, из которых был выбран наиболее результативный. Праймеры и зонды были проанализированы in silico с использованием программного обеспечения AutoDimer (Vallone and Butler, 2004).Зонды, меченные FAM / BkFQ, и праймеры были синтезированы компанией Integrated DNA Technologies (Бельгия).

Таблица 2. Праймеры и зонды, предназначенные для количественного определения вектора AAVrh.10hCLN2 и AAVrh.10-mCherry.

Предварительная обработка вирусных векторов перед ПЦР

В ПЦР образцы использовали напрямую (без предварительной обработки) или были предварительно обработаны одним или комбинацией обработок, описанных ниже. Список предварительных обработок, используемых в каждом из экспериментов, представлен в таблице 1.

первоначально использовалась для оценки эффективности анализа CMV в формате ddPCR и для тестирования образцов контроля качества в процессе, состоящих из частично очищенного AAV. Реакция протеиназы К состояла из протеиназы К (Qiagen, Германия), 0,5 М ЭДТА (Sigma-Aldrich, США), 10% SDS (Sigma-Aldrich, США) и воды, свободной от нуклеаз (NFW). Смесь инкубировали при 55 ° C в течение 60 мин в термошейкере, встряхивая при 650 об / мин. Протеиназу К инактивировали инкубацией при 95 ° C в течение 15 мин.

Всякий раз, когда протокол расщепления ДНКазой, описанный Lock et al. (2014), он всегда предшествовал любому другому лечению и использовал только четыре единицы на реакцию. Влияние расщепления ДНКазой на количественную оценку вектора с помощью ddPCR оценивали путем тестирования шести различных концентраций фермента (0, 2, 4, 8, 10 и 20 единиц на реакцию) в реакционном объеме 200 мкл с 2 × 10 ⁸ ожидаемых инкапсидированных векторных геномов на реакцию. Реакционная смесь для ДНКазы состояла из буфера Ambion DNase I (Thermo Fisher Scientific, США), воды, свободной от нуклеаз (NFW), образца и различных концентраций Ambion DNase I (Thermo Fisher Scientific, США).Смесь осторожно перемешивали и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин.

Высвобождение геномов из капсида и высвобождение вторичной структуры выполняли с этапом денатурации, когда образцы инкубировали при 95 ° C в течение 15 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры.

Области ITR были вырезаны из вектора, чтобы снизить стабильность вторичной структуры после денатурации капсида. Переваривание рестрикции вектора проводили с 0,5 мкл рестрикционного фермента Sal I (New England Biolabs, США) и 22 мкл рестрикционного буфера (New England Biolabs, США).Реакционную смесь инкубировали при 37 ° C в течение 60 мин с последующей инактивацией фермента при 65 ° C в течение 20 мин.

Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)

Отрицательный (NTC, без матричного контроля) и положительный (известное количество целевой ДНК) контроли использовали в каждом прогоне. Реакционные смеси в конечном объеме 10 мкл состояли из 5,5 мкл TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix (Life Technologies, Великобритания), 0,5 мкл праймеров и смеси зондов (конечная концентрация праймеров составляла 900 нМ, а зондов 250 нМ). 2 мкл NFW и 2 мкл ДНК или матрицы AAV.Реакционные смеси распределяли по отдельным лункам 384-луночного планшета, герметично закрывали и центрифугировали. После центрифугирования планшет переносили в систему 7900 HT Real-Time PCR (Applied Biosystems, США). Условия цикла составляли 2 минуты при 50 ° C и 10 минут при 95 ° C с последующими 40 циклами двухступенчатого термического профиля, состоящего из 15 секунд при 95 ° C и 60 секунд при 60 ° C.

Стандартная кривая, позволяющая количественно оценить образцы для сравнения протоколов (образцы 1–5 в таблице 3), была построена с использованием денатурированного AAVrh.Вектор 10hCLN2 с заданной концентрацией. Он состоял из 6 точек отбора проб в трех экземплярах, которые были приготовлены как 10-кратные серийные разведения исходного материала. Материал для стандартной кривой qPCR был также охарактеризован с помощью ddPCR для повышения точности количественного определения. Для количественной оценки образцов 6–14 (таблица 3) использовали образец AAVrh.10mCherry, охарактеризованный с помощью ddPCR.

Таблица 3. Сравнение титра векторного генома, определенного с помощью кПЦР и ддПЦР на образцах, очищенных с помощью хроматографии CIM.

Количественная ПЦР в реальном времени использовалась одновременно с ддПЦР во всех экспериментах, кроме оценки концентрации ДНКазы. Оценка вариабельности анализа CMV проводилась на двух разведениях необработанного AAVrh.10hCLN2, которые позже использовались также в качестве второго и третьего разведения для стандартной кривой при тестировании частично очищенных образцов (позже названных как высокая и низкая концентрация). Во всех других экспериментах количественный анализ проводили на основе стандартной кривой, как описано выше.Количество проанализированных разведений и технических повторов для каждого из экспериментов подробно представлено в Таблице 1.

Все данные были проанализированы с помощью программного обеспечения SDS версии 2.4. Дальнейшие анализы были выполнены в Microsoft Excel.

Цифровая ПЦР с каплями (ddPCR)

Абсолютную количественную оценку векторных геномов проводили с помощью ddPCR. Все эксперименты, в которых использовалась ддПЦР, представлены в таблице 1, которая также включает информацию о количестве разведений и технических повторах для каждого из экспериментов.Два из трех разведений, использованных для тестирования переноса анализа CMV в ddPCR, были такими же, как и в qPCR (высокая и низкая концентрация), с одним дополнительным 10-кратным разведением, которое также было частью стандартной кривой qPCR.

Отрицательный (NTC, без матричного контроля) и положительный (известное количество целевой ДНК) контроли использовали в каждом прогоне. Реакционная смесь для ddPCR состояла из 10 мкл 2 × ddPCR Supermix для зондов (без dUTP) (Bio-Rad, США), 1 мкл праймеров и смеси зондов (конечная концентрация праймеров составляла 900 нМ, а зондов 250 нМ). 4 мкл NFW и 5 мкл образца AAV.Пять микролитров NFW добавляли вместо ДНК-матрицы в качестве нематричного контроля (NTC). Готовили 10% избыток каждой реакционной смеси, включая образец, и пипеткой вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (Eppendorf, Германия). Каждый образец тестировали в двух экземплярах и в трех последовательных 10-кратных разведениях. Планшеты герметично закрывали, кратковременно встряхивали, центрифугировали и переносили в автоматический генератор капель QX200 (Bio-Rad, США), где автоматически генерировались капли. 96-луночный планшет (Eppendorf, Германия) с образовавшимися каплями переносили в термоциклер C1000 Touch (Bio-Rad, США).Условия цикла составляли 10 минут при 95 ° C с последующими 40 циклами двухступенчатого термического профиля, состоящего из 30 секунд при 95 ° C и 60 секунд при 60 ° C со скоростью линейного изменения 2,5 ° C / с. После циклирования планшет переносили в Droplet Reader QX200 (Bio-Rad, США). Анализ данных проводили с помощью программы QuantaSoft (версия 1.7.4.0917; Bio-Rad, США). Порог разделения отрицательных и положительных капель был установлен вручную чуть выше кластера отрицательных капель. Данные из скважин с количеством капель ниже 8000 были исключены из анализа.Необработанные данные были экспортированы из QuantaSoft и затем проанализированы в Microsoft Excel. Число копий было рассчитано на мкл, используя объем 0,739 нл на каплю (Košir et al., 2017), чтобы обеспечить наиболее точные результаты.

Прогноз вторичной структуры

Мы провели анализ возможных вторичных структур последовательности векторной конструкции с Mfold, чтобы объяснить наблюдаемые различия в определенных титрах. Складывание анализировали при 60 и 99 ° C для выявления различных вторичных структур нашей конструкции.Остальные параметры были установлены по умолчанию.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Просвечивающая электронная микроскопия использовалась для наблюдения вирусных частиц в исходном материале, а также после обработки ДНКазой в эксперименте для оценки различных концентраций ДНКазы. 10–20 мкл суспензии вируса (AAVrh.10hCLN2) наносили на свежевыделенные медные сетки (400 меш, покрытые формвар-углеродом) на 5 мин, промывали и окрашивали 1 каплей 1% (мас. / Об.) Водного раствора. уранилацетата.Сетки изготовлены в двух экземплярах. Сетки наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips CM 100 (FEI, Нидерланды), работающего при 80 кВ. Тщательно исследовали не менее 10 квадратов сетки и делали репрезентативные микрофотографии (камера ORIUS SC 200, Gatan, Inc.) при разном увеличении.

Статистический анализ

Сводка использованных статистических анализов в проведенных экспериментах на основе ПЦР представлена ​​в таблице 1. Среднее и стандартное отклонение (SD) для каждого из проанализированных образцов было рассчитано в таблицах Excel для всех повторностей образцов (разведения и технические повторения).SD также использовался для расчета коэффициента вариации. Статистическая оценка различий между результатами кПЦР и ддПЦР различных анализов и предварительных обработок была выполнена с помощью ANOVA с последующим множественным сравнением средних значений по Тьюки в R studio версии 1.0.143. Различия во всех коэффициентах вариации, полученные после прогонов кПЦР и ддПЦР, оценивали с помощью теста Стьюдента t в Excel.

Результаты

В представленном исследовании мы реализовали целостный подход и исследовали критические точки в векторной количественной оценке и характеристике AAV.Мы оценили переносимость анализа с кПЦР на ддПЦР, сравнили обе платформы и оценили влияние различных протоколов предварительной обработки образцов на количественную оценку. Мы также показали дополнительную ценность внедрения ТЕМ-анализа для характеристики вирусных векторов.

Перенос установленных протоколов qPCR в ddPCR возможен без оптимизации

Сначала мы хотели оценить переносимость анализа с кПЦР на ддПЦР. Для этого мы взяли анализ qPCR, нацеленный на энхансер CMV, и сравнили степень вариабельности полученных результатов на AAVrh.Образец 10hCLN2 после переноса на ddPCR (таблица 1). Кроме того, мы оценили влияние различных вариантов предварительной обработки образцов перед кПЦР и ддПЦР, а именно: только расщепление ДНКазой, только обработка протеиназой К, расщепление ДНКазой с последующей протеиназой К и без обработки (Таблица 1). Результаты КПЦР оценивали индивидуально для двух разведений исходного образца (10-кратная разница; высокая и низкая концентрация). Вариабельность кПЦР и ддПЦР оценивалась с точки зрения кратной разницы в количестве генома между минимальным и максимальным значением четырех повторов для отдельных предварительных обработок, которое варьировалось от 1.От 4 × до 3,2 × для кПЦР и от 1,1 × до 1,6 × для ддПЦР (таблица 4). Разница в кратности между минимальным и максимальным значением для различных обработок составляла 7,7 × для кПЦР и 2,4 × для ддПЦР. Графическое представление кратных изменений количественной ПЦР и ддПЦР в титрах генома предварительно обработанных образцов по сравнению с необработанными представлено на рисунке 1.

Таблица 4. Кратная разница между минимальным и максимальным титром генома для четырех повторностей кПЦР и шести повторностей ддПЦР для каждой предварительной обработки.

Рисунок 1. Оценка вариабельности результатов анализа ЦМВ при различных предварительных обработках с использованием количественной ПЦР и ддПЦР. Разница в кратности изменения представлена ​​для трех предварительных обработок против отсутствия лечения.

Расщепление ДНКазой рекомендуется в качестве предварительной обработки

Чтобы определить минимально необходимый уровень фермента ДНКазы для удаления неинкапсидированной ДНК, мы протестировали шесть различных концентраций ДНКазы (0, 2, 4, 8, 10 и 20 единиц на реакцию) перед ddPCR на AAVrh.10hCLN2. образец с использованием анализа CMV (таблица 1).Мы не ожидали больших различий между большинством методов лечения, поэтому мы провели исследование только с ddPCR из-за его более высокой точности. Мы использовали широкий диапазон концентраций для наблюдения за любой деградацией геномов, которая может высвобождаться из капсидов в результате активности протеиназ, поскольку бычья ДНКаза I может включать протеазы в качестве загрязнителей (McCarty, 1946). На уровне 2 единиц наблюдалось значительное падение титра векторного генома (рис. 2), что указывает на присутствие свободной ДНК. Дальнейшее увеличение концентрации ДНКазы не оказало значительного влияния на определенный титр генома вектора (рис. 2), что указывает на то, что, вероятно, не было неспецифической протеиназной активности ДНКазы, использованной в эксперименте.

Рисунок 2. Влияние различных концентраций ДНКазы в единицах на 200 мкл реакции на титр генома вектора, определенный с помощью ddPCR. Каждую концентрацию ДНКазы тестировали в двух независимых повторах, с двумя разведениями каждое в двух технических повторах, что дало всего восемь точек данных на концентрацию ДНКазы. Планки погрешностей представляют ± 1 стандартное отклонение.

ddPCR работает лучше, чем qPCR на образцах AAVrh.10mCherry на промежуточных этапах последующей очистки

Чтобы проверить влияние различных буферных составов образцов на титрование векторов, мы выполнили последующую очистку собранного лизата, содержащего AAVrh.10мВишня с монолитными колоннами. Мы выбрали четырнадцать различных фракций образцов, полученных из хроматографических прогонов CIMmultus ^TM . Состав буфера в каждом из тестируемых образцов представлен в таблице 3. Эти образцы были проанализированы с помощью кПЦР и ддПЦР с использованием анализа CMV, чтобы оценить, какой метод более подходит для определения титрования векторов в образцах для последующей очистки. Две различные предварительные обработки (только расщепление ДНКазой или расщепление ДНКазой с помощью протеиназы К) были использованы для подгруппы из пяти образцов, а девять образцов были подвергнуты только расщеплению ДНКазой.Количественная оценка с помощью кПЦР показала 37–62% различие между определенным средним векторным количеством образцов при использовании обработки ДНКазой и протеиназой К по сравнению с обработкой только ДНКазой (Таблица 3).

Для первого набора образцов (1–5 в Таблице 3) определенный титр qPCR, основанный на заранее определенной концентрации материала стандартной кривой, был в среднем в 64 раза выше, чем титр, определенный с помощью ddPCR. Когда мы использовали концентрацию материала стандартной кривой, измеренную с помощью ddPCR, мы наблюдали разницу в 11 раз.5 × между заранее определенной концентрацией и измеренной (1E + 7 копий / мл, учитываемых при кПЦР, против 8,72E + 5 копий / мл, измеренных с помощью ddPCR). Путем применения этой новой концентрации в расчетах (результаты представлены в таблице 3) разница между значениями qPCR и ddPCR была уменьшена до среднего коэффициента 5,5 ×. Мы наблюдали ингибирование амплификации в реакции qPCR для трех образцов (7, 10, 14) с высокой концентрацией KPB. Для определения титров образцов 6–14 (таблица 3) использовался другой материал стандартной кривой, но он также был охарактеризован с помощью ddPCR, чтобы избежать слишком большой разницы.В этом случае титры, определенные с помощью qPCR, были в среднем только на 11% выше по сравнению с ddPCR, что находится в пределах ожидаемой вариации этих методов. В целом, последний метод был менее подвержен влиянию различных обработок и показал меньшие различия в определенном титре в образцах с разными обработками (0–35% систематической ошибки). Коэффициент вариации (CV%) между техническими повторами был значительно ниже в ддПЦР, что позволяет предположить, что это более последовательный метод анализа промежуточных проб до и после анализа.

Предварительные обработки и анализы, приведенные к различным титрам генома вектора

Дополнительные анализы, нацеленные на ряд последовательностей в конструкции AAVrh.10hCLN2 (рис. 3), позволили измерить целостность векторной ДНК и влияние положения мишени в геноме.

Рисунок 3. Схематическое изображение аннотированных областей в векторах AAVrh.10h. Области, на которые нацелены различные тесты, отмечены короткими линиями над целевым геном.

С точки зрения безопасности и эффективности продукта генной терапии очень важно, чтобы капсиды AAV содержали полные конструкции.Это можно проверить с помощью тестов, нацеленных на весь геном, где результаты количественной оценки должны быть сопоставимы для всех. Мы протестировали четыре анализа, распределенных по всей длине конструкции, и каждый нацелен на другой ген в векторной конструкции. Мы сравнили реакцию всех анализов с кПЦР и ддПЦР на одном и том же исходном материале, который подвергался разным обработкам перед ПЦР: (1) расщепление только ДНКазой, (2) расщепление ДНКазой и денатурация капсидов или (3) расщепление ДНКазой, денатурация капсиды и с ограничением ITR регионов.Средние количества векторных геномов, определенные четырьмя различными анализами для всех обработок, приведены на Рисунке 4.

Рисунок 4. Средний титр векторного генома, определенный с четырьмя целевыми последовательностями (энхансер CMV, бета-актин, бета-глобин, полиА) с помощью кПЦР и ддПЦР после каждой из трех различных предварительных обработок. Планки погрешностей представляют ± 1 стандартное отклонение. Заполненные точки предназначены для кПЦР и пустые для ддПЦР. Синий – только ДНКаза, Оранжевый – ДНКаза и денатурация и Темно-серый – ДНКаза, денатурация и ограничение.Каждая точка представляет не менее восьми повторов (подробные сведения о количестве реплик см. В Таблице 1). Зеленые квадраты заключают в себя группы результатов, определенных статистическим анализом (множественное сравнение средних значений Тьюки; p <0,001).

Статистическая оценка различий между отдельными экспериментами позволила выявить семь статистически различных групп с комбинациями индивидуальных обработок и анализов (рисунок 4 и дополнительный лист данных 1).

Самый низкий титр векторного генома был определен для образцов, обработанных только ДНКазой.Это также было единственное лечение без значительных различий в определенном титре генома вектора по всем анализам и обоим методам ПЦР (рис. 4). Эта же группа также включала обработку ДНКазой и денатурацию с помощью анализа ddPCR CMV. Когда образцы, обработанные ДНКазой и денатурацией, тестировали с помощью анализов, нацеленных на другие области конструкции (бета-актин, бета-глобин, PolyA), наблюдались более высокие титры (фиг. 4). Комбинация всех трех обработок (ДНКаза, денатурация и ограничение областей ITR) дополнительно увеличивала итоговый титр в каждом формате анализа (рис. 4).

Мы провели анализ возможных вторичных структур последовательности векторной конструкции с Mfold, чтобы объяснить наблюдаемые различия в определенных титрах. Предполагаемая вторичная структура векторной ДНК была относительно сложной при 60 ° C с одной большой однонитевой петлей (дополнительный рисунок 2 в дополнительном листе данных 2). Эта открытая петля находилась в области анализа бета-глобина и полиА, что при нацеливании на анализ ПЦР приводило к немного более высокому титру, что могло быть результатом лучшей доступности.Предсказанная вторичная структура конструкции без областей ITR была другой и менее стабильной при 60 ° C (дополнительный рисунок 3 в дополнительном листе данных 2). По-прежнему предполагалось, что области ITR представляют собой двухцепочечную структуру при 99 ° C (дополнительный рисунок 4 в дополнительном листе данных 2).

ddPCR имеет более низкий коэффициент вариации

Мы использовали все проведенные анализы и их результаты для оценки изменчивости определенных коэффициентов вариации. Мы включили различные виды образцов, поступающих в процессе последующей очистки, чтобы охватить множество возможных образцов в реальных испытаниях.Всего 73 и 63 образца были протестированы с помощью ddPCR и qPCR соответственно. Согласно анализу, значительно более низкий коэффициент вариации наблюдался с ddPCR по сравнению с qPCR (рис. 5) для образцов, полученных на различных последующих стадиях очистки. Таким образом, ддПЦР не только более точный, но и предпочтительный метод для образцов, содержащих ингибиторы ПЦР.

Рис. 5. Распределение коэффициентов вариации для результатов, полученных с помощью ddPCR и qPCR при тестировании 73 и 62 образцов, соответственно.Прямоугольники представляют значения между Q1 и Q3, тогда как усы представляют 1,5 межквартильного размаха, горизонтальные линии представляют медианы, крестики представляют средние значения. Отдельные точки за пределами усов представляют собой выбросы. CV% для каждого образца рассчитывали по меньшей мере из шести повторов. Результаты обеих групп достоверно различались ( t -тест, p <0,001).

Анализ ТЕА выявил вирусные агрегаты и поврежденные капсиды

AAVrh.10hCLN2 наблюдали с помощью ПЭМ, чтобы определить влияние различных предварительных обработок на целостность вектора и сопоставить этот эффект с количественными анализами.Мы выполнили ТЕМ-анализ образцов, которые были подвергнуты воздействию различных концентраций ДНКазы в качестве меры деградации вирусных капсидов высокой концентрацией ДНКазы.

Мы идентифицировали полные и пустые вирусные частицы (Рисунки 6A – C), более мелкие частицы (Рисунок 6C) и некоторые агрегаты (Рисунок 6D), которые, вероятно, также включали поврежденные частицы. В образцах, обработанных ДНКазой, большинство вирусных частиц было агрегировано (рис. 7), что могло быть следствием неоптимального буфера для анализа ТЕМ (буфер для реакции ДНКазы) или высокого содержания белка.

Рис. 6. Микрофотографии AAVrh.10hCLN2, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Полные (яркие сферы; белые стрелки) и пустые (сферы с более темным пятном; черные стрелки) вирусные частицы показаны под разным увеличением (A – C) . Совокупность вирусных частиц показана на панели (D) .

Рис. 7. Микрофотографии, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии AAVrh.10hCLN2, обработанного различными концентрациями ДНКазы (2, 8, 10 и 20 ед.).Для каждой концентрации ДНКазы показаны две репрезентативные микрофотографии при разном увеличении. Агрегаты белков (ферменты и / или вирусные частицы) видны на всех микрофотографиях, в то время как отдельные вирусные частицы не наблюдались.

ДНКазой, были сопоставимы по вирусному титру и содержанию агрегатов, независимо от концентрации ДНКазы. Не наблюдалось уникального повреждающего действия на капсиды AAV из-за обработки ДНКазой. Кроме того, мы наблюдали множество белковых агрегатов или фон в образцах, обработанных ДНКазой (рис. 7).При увеличении концентрации ДНКазы наблюдалось увеличение белковых примесей и агрегатов, вероятно, в результате агрегации ДНКазы.

Обсуждение

Мы использовали разные методы, чтобы получить более общий обзор конкретного вектора AAV. Основная цель нашего исследования заключалась в том, чтобы продемонстрировать, что разные методы количественной оценки и характеристики векторов AAV должны использоваться бок о бок, поскольку результаты отдельных методов могут вводить в заблуждение. Во-первых, наше внимание было сосредоточено на сравнении количественной ПЦР и ддПЦР, которые являются общими методами выбора для количественного определения нуклеиновых кислот.Наши результаты выявили необходимость специальной предварительной обработки образцов и показали превосходство ддПЦР с точки зрения надежности и точности количественного определения. Затем мы объединили эти результаты с анализом ПЭМ, который действовал как дополнительный метод к молекулярным методам и объяснил некоторые различия, обнаруженные в тестах ПЦР.

Перенести протокол qPCR target CMV в ddPCR было легко. Обработка только протеиназой К привела к более высокому титру по сравнению с предшествующим расщеплением ДНКазой из-за присутствия свободной, неинкапсидированной ДНК.Использование ДНКазы, уже в количестве двух единиц на реакцию, уменьшило количество обнаруженных векторных геномов до стабильной точки, когда, вероятно, вся свободная конструктивная ДНК была разрушена. Стабильный титр при различных концентрациях ДНКазы указывает на отсутствие протеиназной активности ДНКазы I и, следовательно, подтверждает правомерность включения этого шага, как описано в Lock et al. (2014), но с более низкой концентрацией ДНКазы, чем сообщалось ранее (Lock et al., 2010, 2014; Fagone et al., 2012).

Чтобы оценить применимость кПЦР и ддПЦР для титрования образцов в процессе, учитывая, что кПЦР уже была показана как сопоставимая с ддПЦР для очищенных образцов AAV (Lock et al., 2010, 2014), AAVrh.10mCherry, полученный из очищенного лизата, полученного из клеток HEK293T, очищенного на монолитных колонках CIMmultus ^TM , отбирали пробы на каждой из нескольких стадий в схеме последующей очистки. В процедуре очистки использовали буферы с высокими концентрациями солей. Мы наблюдали ингибирование амплификации qPCR в трех образцах, но не наблюдали ингибирования с ddPCR. В этих трех образцах наиболее вероятной причиной ингибирования была высокая концентрация KPB.Коэффициент вариации был значительно ниже для ddPCR в частично очищенных образцах (Таблица 3), а также для всех протестированных образцов вместе (Рисунок 5). Это указывает на то, что ддПЦР имеет лучшую точность и, таким образом, представляет собой лучший выбор для абсолютного количественного определения производственных образцов на этапах векторной очистки, отчасти из-за его пониженной чувствительности к компонентам состава. Это особенно важно для валидации анализов для производственного контроля, когда валидацию следует проводить для каждой матрицы индивидуально.ddPCR может выполняться без предварительной экстракции ДНК, что обеспечивает быстрое время анализа и, таким образом, может быть полезно для быстрого определения выхода последующих процессов (Dorange and Le Bec, 2018). Мы видели, что на самом деле нет матричного вмешательства в ddPCR по нисходящим (таблица 3) или восходящим образцам (опыт исследовательской деятельности по контракту).

Использование тестов, охватывающих весь геном, лучше всего информирует о наличии инкапсидированного целого генома. Мы сравнили анализы, охватывающие различные области векторного генома (рис. 3), с использованием qPCR и ddPCR после различных обработок, чтобы проверить их возможное влияние на титрование векторного генома.Не было различий в измеренном титре между образцами, предварительно обработанными ДНКазой. Предыдущие отчеты предполагали различную эффективность амплификации для анализов по всему геному AAV в кПЦР (Fagone et al., 2012; Wang et al., 2013). Добавление стадии денатурации после расщепления ДНКазой уже привело к значительному увеличению титра, определяемого каждым из нескольких анализов и платформ ПЦР (рис. 4). Кроме того, мы подготовили образцы, в которых после расщепления ДНКазой и денатурации области ITR были удалены из векторного генома рестрикционными ферментами, чтобы исключить возможное влияние областей ITR.Это увеличивало определенный титр в некоторых случаях, но не во всех методах анализа (рис. 4). Предполагаемая вторичная структура для нашего вектора была довольно сложной (дополнительный рисунок 2 в дополнительном листе данных 2), но открытая петля, содержащая целевые области для бета-глобина и анализов полиА, вероятно, является причиной более высоких результатов титров с использованием этих двух целевых сайтов. Мы не могли объяснить все различия между анализами и предварительной обработкой вторичной структурой. Таким образом, мы предположили, что вирусы могут присутствовать в совокупности.Возможные агрегаты могут вызвать искаженные результаты ddPCR, поскольку разделение вирусных частиц на капли не будет случайным. Сильная агрегация также может ограничивать доступ к геномам с помощью qPCR. Мы исследовали образцы с помощью ПЭМ и подтвердили образование агрегатов, особенно после реакции ДНКазы. Остается неясным, повреждает ли ДНКаза частицы, вызывая агрегацию.

Образец / продукт аденоассоциированного вируса должен иметь достаточное качество / чистоту, если он будет использоваться в клинических испытаниях или в качестве конечного лекарственного препарата.Визуализирующие подходы, такие как ПЭМ, необходимы для оценки целостности и чистоты образцов вирусов. Используя ПЭМ, мы смогли увидеть отдельные вирусные частицы и определить, были ли они пустыми, полными, поврежденными, агрегированными или нетипичного размера. Этот анализ помог нам объяснить наши молекулярные результаты, которые показали, что что-то происходит на уровне частиц. Было показано, что ТЕА-анализ является неотъемлемой частью характеристики вирусного вектора, и мы предлагаем использовать его в регулярном контроле качества процесса производства вирусного вектора.Тем не менее, информации только о полных и / или пустых капсидах может быть недостаточно, потому что то, что на самом деле находится внутри капсидов, будет иметь большее значение. AAV могут содержать относительно длинные фрагменты ДНК, и заражение интактными частицами, содержащими неизвестную последовательность ДНК, которая стала инкапсидированной во время производства, может представлять некоторые проблемы для здоровья и регулирования. Различные подходы к высокопроизводительному секвенированию могут помочь решить этот вопрос и пролить свет на безопасность препаратов AAV.

Основываясь на нашей предыдущей работе с ddPCR (Dreo et al., 2014; Pavšič et al., 2016; Dobnik et al., 2018), мы ожидаем, что пределы обнаружения и количественной оценки будут сопоставимы с qPCR. Межлабораторная вариабельность, наблюдаемая при кПЦР (Lock et al., 2010; Ayuso et al., 2014), вероятно, меньше при ddPCR из-за отсутствия зависимости от стандартной кривой и эталонного материала золотого стандарта. Это устранило бы необходимость в стандартной единице дозирования вектора, упомянутой D’Costa et al. (2016), по которым лаборатории должны калибровать свои измерения.

Векторные геномы можно легко обнаружить и количественно оценить с помощью ПЦР, но они должны быть инкапсидированы, чтобы быть инфекционными. Мы не рассматривали инфекционность нашего вектора в представленном исследовании. Уже было показано, что титр векторного генома и титр инфекционного генома могут быть и обычно существенно различаются (Lock et al., 2010; Ayuso, 2016). В будущих исследованиях было бы важно сопоставить это различие либо с фрагментированным геномом, либо с поврежденными капсидами.

Число клинических испытаний с использованием вирусных векторов неуклонно растет.Хотя пока нет данных, подтверждающих эту идею, мы ожидаем, что количество вирусов, которые могут быть выпущены в окружающую среду от пациентов, увеличится после будущих одобрений генной терапии AAV. Это может вызвать некоторые опасения, поэтому, вероятно, потребуется наладить мониторинг окружающей среды, который уже существует для цитостатиков. Обнаружить низкую концентрацию вирусов в пробах окружающей среды – непростая задача. Совершенно определенно существует проблема стабильности AAV в окружающей среде, которую необходимо изучить для препаратов генной терапии AAV, прежде чем переходить к мониторингу окружающей среды.Мы показали, что концентрация и количественная оценка вирусов в воде (например, сточных водах, реках, море) возможны (Rački et al., 2014a, b; Balasubramanian et al., 2016), а также могут предоставить четкие данные о количестве вирусы генной терапии, потенциально попадающие в окружающую среду, после оценки их стабильности.

Заключение

В заключение, мы показали, что характеристика вирусных векторов намного информативнее при сочетании молекулярных подходов и микроскопии, которые предоставляют ортогональные методы для характеристики вирусных векторов.Наши результаты служат руководством для создания схемы аналитического тестирования, необходимой для определения идентичности и чистоты вирусных векторов AAV. Это особенно важно при разработке оптимизированного процесса для их крупносерийного производства. Любая необходимая оптимизация исходных и последующих процессов должна определяться выбранной комбинацией аналитических методов, которые позволяют проводить пошаговую аналитическую характеристику вируса, результаты которой определяют итеративное уточнение продукции по выходу, чистоте и эффективности.Чтобы сделать шаг вперед, мы ожидаем, что новые высокопроизводительные технологии секвенирования, такие как секвенирование Oxford Nanopore Technologies MinION, могут предложить дополнительную информацию, которая будет хорошо дополнять более традиционные аналитические подходы и, скорее всего, станет необходимостью в будущем. Таким образом, ddPCR, TEM и высокопроизводительное секвенирование определенно представляют собой комбинацию методов, которые следует использовать в процессе характеризации AAV. Тем не менее, точную корреляцию между результатами различных методов еще предстоит установить.Недавно сообщалось о структуре капсидного белка AAV2 с высоким разрешением (Tan et al., 2018). В дополнение к получению информации с помощью структурного анализа мы ожидаем, что в будущем внимание будет также уделяться подходам для характеристики целостности белкового капсида, поскольку это недостающее звено между корреляциями известных аналитических данных с инфекционностью.

Взносы авторов

DD, PK и MR разработали эксперименты. TJ, NK, MTŽ и ML внесли свой вклад в сбор данных. DD, PK, TJ, NK, MTŽ и ML провели анализ данных.DD, PK, TJ, NK, MTŽ и MR внесли свой вклад в интерпретацию данных. SK, JM и HL подготовили и предоставили как векторы AAVrh.10, так и протокол энхансера CMV qPCR. Д.Д. написал первый черновик рукописи. PK, TJ, NK и ML написали разделы рукописи. Все авторы прочитали, критически отредактировали черновик рукописи и одобрили представленную версию.

Финансирование

Мы благодарим Словенское исследовательское агентство (номера контрактов P4-0165 и P4-0407) за финансирование исследования.

Заявление о конфликте интересов

ML используется в BIA Separations, компании, которая производит и продает монолитные колонки CIM для концентрации и очистки вирусов.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Пита Ганьона за критический пересмотр рукописи и Тинкару Тинту за техническую помощь в количественной оценке образцов AAV.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01570/full#supplementary-material

Список литературы

Ай, Дж., Ибрагейм, Р., Тай, П. В. Л. и Гао, Г. (2017). Масштабируемый и точный метод количественной оценки векторных геномов рекомбинантных аденоассоциированных вирусов в неочищенном лизате. Hum. Gene Ther. Методы 28, 139–147. DOI: 10.1089 / hgtb.2016.173

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ayuso, E., Blouin, V., Lock, M., McGorray, S., Леон, X., Альвира, M. R., et al. (2014). Производство и характеристика эталонного стандартного рекомбинантного аденоассоциированного вируса типа 8. Hum. Gene Ther. 25, 977–987. DOI: 10.1089 / hum.2014.057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Balasubramanian, M. N., Rački, N., Gonçalves, J., Kovač, K., nidarič, M. T., Turk, V., et al. (2016). Улучшенное обнаружение патогенных кишечных вирусов в прибрежной морской среде путем концентрации с использованием метакрилатных монолитных хроматографических опор в сочетании с количественной ПЦР. Water Res. 106, 405–414. DOI: 10.1016 / j.watres.2016.10.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

D’Costa, S., Blouin, V., Broucque, F., Penaud-Budloo, M., Fçranois, A., Perez, I.C., et al. (2016). Практическое использование эталонных стандартов рекомбинантных векторов AAV: основное внимание уделяется титрованию векторных геномов методом свободной ITR qPCR. Мол. Ther. Методы клин. Dev. 3: 16019. DOI: 10.1038 / mtm.2016.19

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де, Б.П., Чен, А., Салами, К. О., Ван де Грааф, Б., Розенберг, Дж. Б., Пагович, О. Е. и др. (2018). Анализ активности in vivo для векторов генной терапии на основе аденоассоциированного вируса с использованием AAVrh.10 в качестве примера. Hum. Gene Ther. Методы 29, 146–155. DOI: 10.1089 / hgtb.2017.246

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Добник Д., Спилсберг Б., Богожалец Кошир А., Штебих Д., Мориссет Д., Холст-Йенсен А. и др. (2018). «Протоколы мультиплексной капельной цифровой ПЦР для количественной оценки событий ГМ кукурузы», в Digital PC , под ред.Карлин-Нойман и Ф. Бизуарн (Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press), DOI: 10.1007 / 978-1-4939-7778-9_5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доранж, Ф., и Ле Бек, К. (2018). Аналитические подходы к характеристике производства и очистки векторов AAV: достижения и проблемы. Cell Gene Ther. Insights 4, 119–129. DOI: 10.18609 / cgti.2018.015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дрео, Т., Пирц, М., Рамшак,., Павшич, Я., Milavec, M., el, J., et al. (2014). Оптимизация подходов к капельному цифровому ПЦР-анализу для обнаружения и количественной оценки бактерий: тематическое исследование бактериального ожога и коричневой гнили картофеля. Анал. Биоанал. Chem 406, 6513–6528. DOI: 10.1007 / s00216-014-8084-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фэгон, П., Райт, Дж. Ф., Натвани, А. С., Ниенхейс, А. В., Давидофф, А. М., и Грей, Дж. Т. (2012). Системные ошибки в количественном титровании полимеразной цепной реакцией самокомплементарных аденоассоциированных вирусных векторов и улучшенные альтернативные методы. Hum. Gene Ther. Методы 23, 1–7. DOI: 10.1089 / hgtb.2011.104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кошир, А. Б., Дивието, К., Павшич, Ю., Паварелли, С., Добник, Д., Дрео, Т. и др. (2017). Изменчивость объема капель как критический фактор для точности абсолютного количественного определения с использованием цифровой ПЦР капель. Анал. Биоанал. Chem. 409, 6689–6697. DOI: 10.1007 / s00216-017-0625-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Замок, М., Альвира, М. Р., Чен, С.-Дж., и Уилсон, Дж. М. (2014). Абсолютное определение титров генома одноцепочечных и самокомплементарных аденоассоциированных вирусных векторов методом Droplet Digital PCR. Hum. Gene Ther. Методы 25, 115–125. DOI: 10.1089 / hgtb.2013.131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лок, М., МакГоррей, С., Ауриккио, А., Аюсо, Э., Бичем, Э. Дж., Блуин-Тавель, В. и др. (2010). Характеристика стандартного референсного материала рекомбинантного аденоассоциированного вируса 2 типа. Hum. Gene Ther. 21, 1273–1285. DOI: 10.1089 / hum.2009.223

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маккарти Д., Монахан П. и Самульски Р. (2001). Самокомплементарные векторы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (scAAV) способствуют эффективной трансдукции независимо от синтеза ДНК. Gene Ther. 8, 1248–1254. DOI: 10.1038 / sj.gt.3301514

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маккарти, М.(1946). Очистка и свойства дезоксирибонуклеазы, выделенной из поджелудочной железы говядины. J. Gen. Physiol. 29, 123–139. DOI: 10.1085 / jgp.29.3.123

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мулье П. и Снайдер Р. О. (2008). Международные усилия по созданию эталонных стандартов рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов. Мол. Ther. 16, 1185–1188. DOI: 10,1038 / мт.2008,125

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pacouret, S., Bouzelha, M., Shelke, R., Andres-Mateos, E., Xiao, R., Maurer, A., et al. (2017). AAV-ID: быстрый и надежный анализ для оценки согласованности препаратов AAV от партии к партии. Мол. Ther. 25, 1375–1386. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2017.04.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Павшич, Й., Жел, Й., и Милавец, М. (2016). Цифровая ПЦР для прямого количественного определения вирусов без выделения ДНК. Анал. Биоанал. Chem. 408, 67–75.DOI: 10.1007 / s00216-015-9109-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пьедра, Дж., Онтиверос, М., Миравет, С., Пеналва, К., Монфар, М., и Шильон, М. (2015). Разработка быстрого, надежного и универсального метода на основе пикогрина для титрования аденоассоциированных векторов. Hum. Gene Ther. Методы 26, 35–42. DOI: 10.1089 / hgtb.2014.120

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рачки, Н., Дрео, Т., Гутьеррес-Агирре, И., Блеец, А., Равникар, М. (2014a). Цифровая ПЦР с каплями обратной транскриптазы показывает высокую устойчивость к ингибиторам ПЦР из образцов растений, почвы и воды. Заводские методы 10:42. DOI: 10.1186 / s13007-014-0042-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рачки Н., Мориссет Д., Гутьеррес-Агирре И. и Равникар М. (2014b). Одностадийная цифровая ПЦР с ОТ-каплями: прорыв в количественной оценке РНК-вирусов, передаваемых через воду. Анал. Биоанал. Chem. 406, 661–667. DOI: 10.1007 / s00216-013-7476-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Самульски, Р. Дж., Чанг, Л. С., и Шенк, Т. (1989). Свободные от помощников запасы рекомбинантных аденоассоциированных вирусов: нормальная интеграция не требует экспрессии вирусных генов. J. Virol. 63, 3822–3828.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Соммер, Дж. М., Смит, П. Х., Партхасарати, С., Айзекс, Дж., Виджай, С., Киран, Дж. И др. (2003).Количественная оценка аденоассоциированных вирусных частиц и пустых капсидов путем измерения оптической плотности. Мол. Ther. 7, 122–128. DOI: 10.1016 / S1525-0016 (02) 00019-19

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сонди, Д., Петерсон, Д. А., Джаннарис, Э. Л., Сандерс, К. Т., Мендес, Б. С., Де, Б. и др. (2005). Опосредованный AAV2 перенос гена CLN2 в мозг грызунов и нечеловеческих приматов приводит к долговременной экспрессии TPP-I, совместимой с терапией LINCL. Gene Ther. 12, 1618–1632. DOI: 10.1038 / sj.gt.3302549

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tan, Y.Z., Aiyer, S., Mietzsch, M., Hull, J.A., Mckenna, R., Grieger, J., et al. (2018). Структура капсидного варианта AAV2 с поправкой на кривизну по Эвальду менее 2 Å. Нац. Коммуна 9: 3628. DOI: 10.1038 / s41467-018-06076-6076

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Ф., Цуй X., Ван М., Сяо В. и Сюй Р. (2013).Надежная и выполнимая стратегия qPCR для титрования векторов AAV. Med. Sci. Монит. Basic Res. 19, 187–193. DOI: 10.12659 / MSMBR.883968

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Является ли биоэлектрический импеданс точным для использования в крупных эпидемиологических исследованиях?

Abstract

Процент телесного жира напрямую связан с риском нескольких хронических заболеваний, но его точное измерение сложно. Анализ биоэлектрического импеданса (BIA) – это относительно простой, быстрый и неинвазивный метод измерения состава тела.Он точно измеряет жировые отложения в контролируемых клинических условиях, но его эффективность в полевых условиях непостоянна. В крупных эпидемиологических исследованиях вместо BIA для измерения ожирения часто используются более простые суррогатные методы, такие как индекс массы тела (ИМТ), окружность талии и соотношение талии и бедер. Мы рассмотрели обоснование, теорию и технику недавно разработанных систем, таких как измерение BIA от стопы (или руки) до стопы, а также элементы, которые могут повлиять на его результаты, в крупных эпидемиологических исследованиях.На результаты BIA влияют такие факторы, как окружающая среда, этническая принадлежность, фаза менструального цикла и основные заболевания. Мы пришли к выводу, что измерения BIA, подтвержденные для конкретных этнических групп, популяций и условий, могут точно измерить жировые отложения в этих популяциях, но не в других, и предполагаем, что для крупных эпидемиологических исследований с различными популяциями BIA может быть не подходящим выбором для измерения состава тела, если не требуется специальная калибровка. уравнения разработаны для разных групп, участвующих в исследовании.

Введение

В этом обзоре мы обсуждаем вопросы, связанные с применением анализа биоэлектрического импеданса (BIA) для измерения состава тела в крупных эпидемиологических исследованиях с участием многонационального населения. Обзор ограничен здоровыми взрослыми и не включает детей, подростков, пожилых людей и нездоровых людей. Самая последняя система, такая как система ступни (или руки) к ступне, является основным предметом этого обзора, и ранняя система тетра-полярных электродов не будет обсуждаться.Эти последние модели легко доступны и просты в использовании.

Процент жира в организме напрямую связан с риском хронических заболеваний, таких как гипертония, дислипидемия, сахарный диабет и ишемическая болезнь сердца [1-4]. В эпидемиологических исследованиях широко использовались суррогатные показатели жирности тела, такие как индекс массы тела (ИМТ), окружность талии, соотношение талии и бедер и толщина кожной складки. Однако эти методы не позволяют точно охарактеризовать людей по составу тела (процентному содержанию жира в организме или мышечной массе), и существуют значительные различия по возрасту, полу и этническим группам [5-7].Несколько методов использовались для оценки процента жира в организме в контролируемых лабораторных условиях. К ним относятся подводное взвешивание (денситометрия), двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DEXA), анализ биоэлектрического импеданса (BIA) и магнитно-резонансная томография (MRI). Однако денситометрия, DEXA и МРТ дороги, неудобны для участника и нецелесообразны для проведения в полевых условиях, поскольку требуют большого специализированного оборудования. По этим причинам их использование в крупных эпидемиологических исследованиях ограничено.

BIA, напротив, является относительно простым, быстрым (занимает всего несколько минут) и неинвазивным, что дает надежные измерения состава тела с минимальной вариабельностью внутри и между наблюдателями [8]; результаты доступны немедленно и воспроизводимы с ошибкой <1% при повторных измерениях [9]. Этот метод впервые стал коммерчески доступным в середине 1980-х годов [10] и требует недорогого портативного оборудования, что делает его привлекательной альтернативой для оценки состава тела в эпидемиологических исследованиях [11].

Принципы метода биоэлектрического импеданса

Анализ BIA основан на том принципе, что электрический ток течет через тело с разной скоростью в зависимости от его состава. Тело состоит в основном из воды с ионами, через которые может протекать электрический ток. Вода в организме локализована в двух отсеках: внеклеточная вода (ECW, примерно 45%) и внутриклеточная вода (ICW, примерно 55%) [12]. С другой стороны, тело также содержит непроводящие материалы (телесный жир), которые обеспечивают сопротивление прохождению электрического тока.Жировая ткань обладает значительно меньшей проводимостью, чем мышцы или кости [13]. Принцип BIA заключается в том, что электрический ток проходит через тело с разной скоростью в зависимости от его состава. Следовательно, существует прямая зависимость между концентрацией ионов и электрической проводимостью и косвенная зависимость между концентрацией ионов и сопротивлением раствора.

Полное сопротивление тела (Z) определяется как сопротивление проводника потоку переменного тока и состоит из двух компонентов: сопротивления (R) и реактивного сопротивления (Xc). Сопротивление (R) является основным противодействием проводника, и на обычной низкой частоте (50 кГц) внеклеточная часть нежировой ткани работает как резистор [14]. Реактивное сопротивление – это дополнительное противодействие или накопление электрического заряда конденсатором в течение короткого периода времени; липидный компонент мембран массы клеток тела (BCM) ведет себя как конденсаторы и уменьшает поток внутриклеточных ионов. На практике импеданс – это величина падения напряжения, когда небольшой постоянный ток (800 мкА) с фиксированной частотой (50 кГц) проходит между электродами, охватывающими тело.Однако безжировая ткань, богатая водой и электролитами, имеет минимальный импеданс и увеличивается до максимума, когда вся безжировая ткань заменяется жировой / жировой тканью. Следовательно, мышечная масса тела и масса жира (FM) могут быть рассчитаны по разнице в проводимости [15].

Другие допущения для измерения BIA заключаются в том, что тело представляет собой ионный проводник цилиндрической формы с однородным составом, фиксированной площадью поперечного сечения и равномерным распределением плотности тока [16,17]; BIA измеряет сопротивление потоку электрического тока через всю жидкость тела.Следовательно, проводящий объем (V), который представляет собой общую воду в организме (TBW) или FFM, напрямую связан с квадратной длиной проводника (S) и обратно коррелирует с сопротивлением площади поперечного сечения (R), в то время как p равно удельной восприимчивости проводника, что дает уравнение: V = p × S ² / R. Исходя из этого предположения, одни и те же руки и ноги соответственно обеспечивают почти 47% и 50% сопротивления всего тела, несмотря на то, что на них приходится 4% и 17% веса тела соответственно.Напротив, туловище, на которое приходится 50% массы тела, дает только 5–12% сопротивления всего тела [12].

Уравнения прогнозирования

Многие эмпирические уравнения были разработаны для оценки TBW, FFM и массы клеток тела (BCM) с использованием пола, возраста, веса, роста и расы в качестве независимых переменных. Однако прогнозные уравнения, как правило, относятся к конкретной популяции и могут быть полезны только для тех популяций, характеристики которых аналогичны характеристикам эталонных популяций [18,19].Когда эти уравнения использовались для прогнозирования состава тела в разных популяциях, результаты были противоречивыми. Разработанные прогнозные уравнения не могут быть обобщены на различные группы населения. Хейворд и Вагнер рассмотрели надежность и обоснованность различных уравнений для афроамериканцев, азиатов и американцев индийского происхождения. Они обнаружили, что большинство исследований показало, что метод BIA не является точным, когда обобщенное уравнение применяется к различным этническим группам [20].

Краткое описание метода биоимпеданса

▪ Основано на том принципе, что телесный жир препятствует электрическому току больше, чем телесный белок

▪ Импеданс – это падение напряжения, когда небольшой постоянный ток с фиксированной частотой проходит между электродами, охватывающими тело

▪ Прогностические уравнения оценивают TBW, FFM и массу клеток тела (BCM) с использованием пола, возраста, веса, роста и расы

Достоверность измерений BIA

Человеческое тело неоднородно ни по длине, ни по площади поперечного сечения, ни по ионному составу. состав, и это влияет на точность измерений BIA [15].Кроме того, импеданс тела варьируется у разных этнических групп и влияет на точность BIA [21]. Валидность рукопашной (Omron BF306 BIA) с моделью 4-C была протестирована среди китайских и японских участников, которые показали разные уровни систематических ошибок в прогнозируемых уровнях телесного жира (SEE = 4,5% BF), которые могли быть результатом разных уровней жировые отложения, возраст и относительный размах рук [22]. Demura et al. в выборке из 50 японских мужчин в возрасте от 18 до 27 лет. аттестованные анализаторы BIA от ступни к ступне (Tanita, TBF-102), от руки к руке (Omron, HBF-300) и от руки к ступне (Selco, SIF-891) в сравнении с гидроденситометрией (HD) [ 23].Они обнаружили более высокую корреляцию между ладонью к стопе (r = 0,96), чем стопой к стопе (r = 0,71), с HD в качестве эталонного метода, и при использовании уравнений производителя было переоценка от 2,2% до 3,3%, поэтому они разработали новые уравнения. для их образца. Jebb et al. проверили достоверность соотношения ступни к ступне (Tanita -350) среди 104 мужчин и 101 женщины, набранных из Центра питания Данна, с использованием DEXA в качестве эталонного метода. Наблюдаемый предел согласия по жировой массе составлял ± 7,9 кг [24]. В этом разделе описан ряд других факторов, влияющих на результаты BIA.

Потребление пищи или напитков

Хотя потребление пищи или жидкости перед измерением BIA влияет на TBW и ECW, общее соглашение об идеальном промежутке времени между приемом пищи и жидкости и измерениями BIA еще не согласовано. Было высказано предположение, что из-за большой площади поперечного сечения туловища даже потребление жидкости объемом до 2 л является «электрически бесшумным» в течение первого часа после употребления [25,26]. Kaminsky и Whaley (1993) сравнили измерения процентного содержания жира в организме после 3 и 12 часов голодания и не обнаружили значительной разницы между этими значениями [27].Лукаски и др. (1986) подчеркивают, что обезвоживание увеличивает сопротивление почти на 40 Ом, что приводит к недооценке FFM на 5,0 кг [28], а Эванс и др. (1998) показали повышенное сопротивление через час после тяжелой еды [ 25]. Напротив, исследователи сообщили, что потребление пищи, ее абсорбция и связанное с этим увеличение движения жидкости в кровоток за 2–4 часа до измерения BIA снижает значение импеданса с 4 до 15 Ом, или <3%, и приводит к завышению оценки. FFM почти на 1.5 кг [29]. Slinde и Rossander-Hulthen, давая стандартную пищу 18 здоровым испытуемым, измерили BIA 18 раз в течение 24 часов. Их результаты показали, что процентное содержание жира в организме варьировалось на 8,8% и 9,9% от самого высокого до самого низкого показателя у женщин и мужчин соответственно [30]. Напротив, Chumlea et al. (1987) не обнаружили влияния потребления пищи до измерения BIA на измерения импеданса [31]. По этим причинам голодание на ночь рекомендуется в качестве рутинной методики стандартизации перед измерением импеданса [17,32].

Упражнение

Хотя упражнения легкой интенсивности не могут повлиять на измерения BIA, умеренные и интенсивные упражнения перед измерениями могут изменить измеренный импеданс с помощью различных механизмов [33]. Например, упражнения увеличивают сердечный выброс и перфузию сосудов и, следовательно, увеличивают приток крови к скелетным мышцам, что нагревает мышцы и снижает сопротивление мышц, что приводит к снижению импеданса [26]. Кроме того, интенсивная деятельность вызывает расширение сосудов, повышение температуры кожи, что также снижает измеренное сопротивление [34].Бег трусцой или езда на велосипеде с умеренной интенсивностью в течение 90–120 мин снижает измеренный импеданс на 50–70 Ом, что приводит к завышению FFM почти на 12 кг [35]. Следовательно, чтобы уменьшить ошибку измерения, BIA не следует выполнять в течение нескольких часов после умеренных или интенсивных упражнений. Кроме того, выбранный режим для каждого индивидуально может повлиять на точность измерения. Swartz и др. В хорошо спланированном исследовании сравнили% BF, измеренный среди людей с высоким или умеренно активным и неактивным гидростатическим весом и BIA, используя различные спортивные режимы и режимы для взрослых в BIA между ногами (Tanita TBF-305).Их результаты показали, что, хотя электрическое сопротивление существенно не различается, выбранный взрослый режим для высоко и умеренно активных людей значительно завышает процент жира в организме [36].

Медицинские условия

Хотя некоторые исследователи применяли метод BIA для различных пациентов и клинических условий, следует отметить, что существуют некоторые медицинские условия, которые изменяют электролиты сыворотки, гематокрит и кровоток, влияя на Z и p , независимо от тела объем жидкости [26].И наоборот, есть некоторые другие заболевания, которые из-за изменения распределения жидкости изменяют измерения Z. Значительное изменение гидратации тела, распределения жидкости и различия в соотношении ECW и ICW, вызванные заболеванием, повлияют на измерения импеданса [37,38]. Среди этих состояний наиболее значимой смешанной переменной является отек дистальных отделов конечностей, который в основном вызван периферической венозной недостаточностью. Эта недостаточность может быть результатом застойной сердечной недостаточности, цирроза, нефротического синдрома, гипоальбуминемии и лимфеодемы [39].Другие медицинские условия, которые влияют на достоверность BIA, включают кожные заболевания, которые могут изменять электрическую передачу электрода к коже у пациентов с ампутациями, полиомиелитом и мышечными дистрофиями. Эти условия будут иметь значительное влияние на применение BIA в клинической популяции [17,40].

Факторы окружающей среды

Хотя изменения окружающей среды существенно не влияют на фактический объем всего тела, они, по-видимому, изменяют измерения Z, изменяя температуру кожи.Результат нескольких исследований показал обратную зависимость между температурой кожи и импедансом, что означает, что импеданс увеличивается при понижении температуры и уменьшается при повышении температуры кожи. Гудивака и др. Наблюдали изменение сопротивления на 8% на частоте 50 кГц при изменении температуры кожи на 8,4 ° C [41]. Таким образом, изменения кожного и мышечного кровотока могут иметь большое влияние на измерения BIA как в клинических, так и в полевых условиях.

Вариабельность внутри субъекта

Из-за повышенных уровней прогестерона в плазме после овуляции и изменения статуса гидратации у женщин может быть выше вариабельность импеданса внутри субъекта.Эффект этой изменчивости был изучен в нескольких исследованиях, и были получены различные результаты. Gualdi-Russo et al. Не обнаружили значительных различий в TBW, оцененном в разные моменты времени на фолликулярной и предменструальной стадиях [42]. С другой стороны, Gleichauf et al. Предположили, что среднее значение нескольких измерений во время менструального цикла можно рассматривать как оценку состава тела [43]. Однако рекомендуется не проводить измерение BIA в то время, когда участница испытывает значительную прибавку в весе, связанную с менструальным циклом [44].Менопауза изменяет состав тела и распределение жира, и женщины испытывают потерю мышечной массы и увеличение веса, жировой массы и центрального отложения жира [45–49]. Отношение жировой / мышечной массы, особенно в нижней части тела, увеличивается [50,51], что может повлиять на расчетное сопротивление при прохождении тока через ноги. Следовательно, точность измерения BIA увеличивается за счет применения специальных уравнений прогнозирования для женщин в постменопаузе [52].

Этническая принадлежность

В последние годы BIA широко применялась среди разных возрастных групп обоих полов, в том числе в основном среди кавказского населения США и Европы, и для этих выборок было разработано несколько уравнений прогнозирования [53-55].Кроме того, было разработано несколько уравнений прогнозирования на основе выборок, полученных от афроамериканцев, выходцев из Латинской Америки и коренных американцев [56]. Stolarczky et al. (1997) показали, что при применении популяционных уравнений для оценки безжировой массы тела среди коренных американок стандартная ошибка оценки (SEE) снизилась с 8,1 кг до 2,6 кг [56]. Однако было высказано предположение, что биологические и физиологические допущения для оценки состава тела, которые в основном основаны на образцах кавказцев, могут быть неточными для других этнических групп. Следовательно, справедливость этих уравнений должна быть проверена на исследуемой популяции . Существует несколько факторов, ответственных за этнические различия, которые могут повлиять на степень и направление ошибки при измерении состава тела с помощью BIA, например:

• Распределение жира Этническая принадлежность влияет на формирование структуры жира и, следовательно, на достоверность уравнений. Было показано, что доля отложения жира на туловище варьируется на 5,7% между разными этническими группами азиатов, американцев мексиканского происхождения, кавказцев и афроамериканцев [57].

• Плотность тела Плотность тела может существенно повлиять на точность оценки безжировой массы тела и массы без жира. Несколько исследований показали, что афроамериканцы имеют большую плотность тела и большую массу тела по сравнению с американцами европеоидной расы [58,59]. Swinburn et al. (1999) обнаружили, что у полинезийцев в Новой Зеландии более высокий уровень обезжиренной массы и меньше жировых отложений, чем у европейцев при любом заданном индексе массы тела [60]. Напротив, Kyle et al. (2001) указали, что у японских мужчин и женщин жировые отложения на 10–12% выше, чем у швейцарских мужчин и женщин [55].Также сообщалось, что азиатское население (китайцы, малайцы, сингапурские индейцы) имеют более высокий процент жира в организме при данном ИМТ, и Wang et al. сообщили о более низкой гидратации FFM у азиатов [6,61].

При расчетах по уравнению прогнозирования предполагалось, что плотность массы без жира не различается между различными этническими группами. Поскольку плотность FFM различается между разными этническими группами, это предположение может быть основным источником ошибок.

• Различия в пропорциональных длинах конечностей Как упоминалось ранее, импеданс демонстрирует прямую зависимость между проводящим объемом (V) и квадратной длиной проводника (S).Поскольку импеданс всего тела в основном основан на импедансе конечностей [62], различия между различными расовыми группами могут в основном быть связаны с различиями в пропорции длин конечностей [63]. Эта гипотеза подтверждается несколькими исследованиями, например, импеданс всего тела нигерийцев был значительно выше, чем у соответствующих европеоидов, но не отличался у разных племен Нигерии [11]. Кроме того, несколько других исследований показали, что у чернокожих людей конечности длиннее, чем у белых, а также увеличивается поясничный лордоз [64-66].

Вообще говоря, на основе предыдущей гипотезы относительно возраста, расы, уровня активности и т. Д. Было высказано предположение, что общее уравнение прогнозирования для разных возрастных и этнических групп не должно применяться без перекрестной проверки исследуемой популяции [61,67 ].

Сводка факторов, влияющих на результаты BIA

▪ Контакт между конечностями и туловищем

▪ Неточная масса тела

▪ Потребление еды и питья (рекомендуется голодание на ночь)

▪ Физическая активность умеренного или интенсивного уровня за 2–3 часа до измерения

▪ Медицинские условия, влияющие на баланс жидкости и электролитов

▪ Температура окружающей среды (холод увеличивает сопротивление)

▪ Индивидуальные характеристики (абдоминальное ожирение, мышечная масса, потеря веса, менструальный цикл, менопауза)

▪ Этнические различия, возможно, опосредованные телом плотность и пропорциональная длина конечностей

Заключение

BIA стало популярным методом оценки состава тела в течение последних двух десятилетий.С 1990 года было опубликовано более 1600 статей с использованием BIA в качестве инструмента измерения состава тела [17,40,68], и наш поиск по ключевым словам состава тела и биоэлектрического импеданса показал, что в период с 2004 года на английском языке было опубликовано 235 статей. и 2006 г., и мы обнаружили разные уровни согласия между различными моделями BIA и эталонными методами. Кроме того, существует множество различных уравнений для калибровки BIA, поэтому результаты исследований следует сравнивать с большей осторожностью.BIA, по-видимому, разумно оценивает состав тела в контролируемых условиях для здоровых и эуволемических взрослых, применяя прогнозное уравнение для конкретной популяции, и не рекомендуется обобщать несколько уравнений для международных эпидемиологических исследований, в которых участвуют участники из разных популяций. Насколько нам известно, для некоторых этнических групп, таких как выходцы из Южной Азии или Ближнего Востока, или африканцы, проживающие в Африке, прогностические уравнения еще не разработаны. Следовательно, необходимо разработать новые прогнозные уравнения или перекрестную проверку существующих уравнений для новых исследуемых популяций.

Если уравнение BIA неправильно выбрано на основании возраста, пола, уровня физической активности, уровня жира в организме и этнической принадлежности, результаты исследования не будут надежными.

Общий BIA – полезный инструмент для клинических исследований, но для крупных эпидемиологических исследований с разнообразным населением, особенно в развивающихся странах, BIA имеет ограниченное применение, если только оценочные исследования не проводятся специально для исследуемых популяций.

% PDF-1.6 % 1 0 объект > / Метаданные 2 0 R / Имена 3 0 R / Контуры 4 0 R / Страницы 5 0 R / StructTreeRoot 6 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 7 0 объект > эндобдж 2 0 obj > транслировать 2019-01-17T17: 30: 59Z2019-01-17T17: 30: 59Z2019-01-17T17: 30: 59ZAdobe Acrobat Pro DC 19.10.20069application / pdf

 
                     С Т А Т Е О Ф Н Е В И О Р К
 ________________________________________________________________________
 
                                   1145
 
                        2021-2022 Очередные сессии
 
                             И Н С Е Н А Т Е
 
                              7 января 2021 г.
                                ___________
 
 Введен сенатором КАМИНСКИМ - дважды прочитал и заказал распечатанный, а когда
   распечатанный для передачи в Комитет по охране окружающей среды
 
 ЗАКОН о внесении поправок в исполнительный закон в отношении сохранения экологических
   целостность, дикая природа и открытое пространство в парке Адирондак
 
   НАРОД ШТАТА НЬЮ-ЙОРК, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В СЕНАТЕ И СБОРКЕ
 BLY, ДЕЙСТВУЙТЕ СЛЕДУЮЩИМ:
 
   Секция 1.Законодательные выводы и заявление о цели. Когда вступил в силу
 в тысяча девятьсот семьдесят третьем, землепользовании парка Адирондак и
 план развития представляет собой историческое применение естественных
 ресурсный контроль землепользования и экономические возможности для парка
 жители и сообщества. Более сорока лет план стремился
 обеспечить оптимальную общую консервацию, защиту, сохранение, развитие
 мент и использование уникальных живописных, эстетических, дикой природы, рекреационных,
 простор, исторические, экологические и природные ресурсы этого заветного
 площадь и существенная взаимозависимость экономических и общественных потребностей
 через сбалансированное распределение землепользования в парке.Наука о сохранении природы и методы планирования землепользования продвинулись вперед
 с момента принятия плана. Сейчас признано, что пространственный
 модель развития полностью, если не больше, экологически важна
 как его общая плотность.
   Разделение земли на большие жилые участки или застройка сельской местности,
 нарушает функцию экосистемы, снижает биотическую целостность, изменяет виды
 поведение и состав, увеличивает конфликты между человеком и дикой природой, фрагменты
 собственность, ухудшает целостное землепользование, подрывает открытое пространство
 характер парка и угрожает его сельскохозяйственным и лесохозяйственным работам.
 пейзажи.Сохранение девелопмента - это подход к проектированию, строительству.
 и руководство разработкой, обеспечивающее функциональную защиту
 природных ресурсов, обеспечивая при этом социальные и экономические выгоды для человека
 сообщества. Это требует процесса, обеспечивающего тщательный анализ
 экологические системы и условия окружающей среды перед застройщиком
 
  ПОЯСНЕНИЕ - Вопрос на ИТАЛИИ (подчеркнут) является новым; дело в скобках
                       [] - это старый закон, который следует опустить. 

 LBD01148-01-1

 С.1145 2
 
 собственно разрабатывает проект. Это экономит время на подготовке подробных
 планы деления, самая дорогая часть дизайна, до конца
 Процесс планирования. Процесс предусматривает меньшие начальные затраты и
 позволяет агентству и общественности вносить вклад до того, как фонды на проектирование будут исчерпаны и
 гарантирует, что разработчик не привержен дизайну, который не
 поддерживается экологическими и экологическими условиями.
   Целью этого закона является усиление землепользования и развития.
 план и его администрирование, включая современный дизайн сохранения
 принципов и сократить разрастание сельских районов.Признается, что
 каждая собственность уникальна, и это подразделение должно осуществляться в
 соблюдение экологически чистых принципов, в том числе соответствующих
 посвящение и сохранение значительных открытых пространств в дальнейшем
 соответствие целей охраны окружающей среды и рабочих ландшафтов.
   § 2. В статью 802 Закона об исполнительной власти добавлены шесть новых
 подразделы 17-b, 18-a, 18-b, 18-c, 43-a и 52-a изложить в следующей редакции:
   17-Б. «КОНСЕРВАЦИОННОЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ» ОЗНАЧАЕТ ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ ЛЮБОГО ТРАКТА
 ЗЕМЛЯ НА ЖИЛОЙ ПОДРАЗДЕЛЕНИИ ДВАДЦАТЬ ПЯТЬ ИЛИ БОЛЕЕ ЛОТОВ, ПОСЫЛКОВ
 ИЛИ САЙТЫ В ЗОНАХ НИЗКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ, ДЕСЯТЬ ИЛИ БОЛЕЕ ЛОТОВ, ПОСЫЛКИ ИЛИ УЧАСТКОВ
 В СЕЛЬСКИХ ТЕРРИТОРИЯХ И ПЯТЬ ИЛИ БОЛЬШЕ ЛОТОВ, ПОСЫЛКОВ ИЛИ УЧАСТКОВ В РЕСУРСЕ
 ОБЛАСТИ УПРАВЛЕНИЯ.ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ, СОСТАВЛЯЮЩЕЕ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО СУЩЕСТВУЮЩИЙ ПРИНЦИП
 ЦИПАЛЬНЫЕ ЗДАНИЯ И СООТВЕТСТВУЮЩАЯ ИНФРАСТРУКТУРА НЕ СЧИТАЕТСЯ
 СОХРАНЕНИЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ. ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ, СОЗДАННОЕ СОГЛАСНО ПУНКТУ C
 ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ПЕРВОГО РАЗДЕЛА ВОСЕМЬСОТ ОДИННАДЦАТЬ ДАННОЙ СТАТЬИ ЯВЛЯЕТСЯ
 НЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ ПО СОХРАНЕНИЮ.
   18-А. «РАЗВИТИЕ КОНВЕРТА» означает ПЛОЩАДЬ ЗЕМЛИ ВНУТРИ ЖИТЕЛЬСТВА-
 ТИАЛ ЛОТ, ПОСЫЛКА ИЛИ УЧАСТОК, НА КОТОРЫХ ВСЕ ГЛАВНЫЕ ЗДАНИЯ, ГОСТЕВОЙ
 КОТТЕДЖИ, ДОРОГИ, ПОДЪЕЗДЫ И ДРУГИЕ СООРУЖЕНИЯ И ИНФРАСТРУКТУРА ДОЛЖНЫ
 БУДЬТЕ РАСПОЛОЖЕН.ДОРОГИ И ТРОПЫ, СВЯЗАННЫЕ С ЛЕСНЫМ ХОЗЯЙСТВОМ, СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВОМ И
 ОТКРЫТЫЙ ОТДЫХ РАЗРЕШЕН ВНЕ РАЗВИТИЯ
 СОБЛЮДЕНИЕ ПЛАНА УПРАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫМИ ПРОСТРАНСТВАМИ И СТРАХОВАНИЯ.
   18-Б. «ЗОНА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ» ОЗНАЧАЕТ, ЧТО ПЛОЩАДЬ ПЛОЩАДКИ ПРОЕКТА.
 РАСШИРЕНИЕ ШЕСТИСТИ ШЕСТИДЕСЯТИ ФУТОВ ЗА ПРЕДЕЛЫ РАЗВИТИЯ
 КАЖДЫЙ САЙТ РАЗРАБОТКИ И ЛЮБЫЕ ПОСТОЯННО РАЗРАБОТАННЫЕ САЙТЫ.
   18-С. "АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛОЩАДКИ" ОЗНАЧАЕТ АНАЛИЗ ПРОЕКТНОЙ ПЛОЩАДКИ.
 КОТОРЫЙ ОПРЕДЕЛЯЕТ ВАЖНЫЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ, ПРИРОДНЫЕ РЕСУРСЫ И
 ОБИТАЙТЕ НА ПЛОЩАДКЕ ПРОЕКТА И ПРИМЕСТИМОСТЬ И ВЫЯВЛЯЕТ ЗОНЫ, ЗАПЕРСЫВАЕМЫЕ
 ING ЗАЩИТА И ПОТЕНЦИАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ УЧАСТНИКОВ, ДОРОГ И
 ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФРАСТРУКТУРА.43-А. «ПЛАН УПРАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫМИ ПРОСТРАНСТВАМИ И СТРАХОВАНИЯ» ОЗНАЧАЕТ ПЛАН ДЛЯ
 СОБСТВЕННОСТЬ, КОНФИГУРАЦИЯ, ПОСТОЯННАЯ ПРАВОВАЯ ЗАЩИТА, ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО,
 СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО И ОТДЫХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОТКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИЙ И УПРАВЛЕНИЕ ДИЗАЙН-
 ПРИРОДНЫЕ ОТКРЫТЫЕ ПРОСТРАНСТВА. УПРАВЛЕНИЕ ОТКРЫТЫМИ ПРОСТРАНСТВАМИ И ПЛАН РАБОТЫ ТАКЖЕ
 ЗНАЧИТ ПЛАН ВЛАДЕНИЯ, КОНФИГУРАЦИИ И УПРАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫМИ
 ПОМЕЩЕНИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОСТОЯННУЮ ЮРИДИЧЕСКУЮ ЗАЩИТУ ОТКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИЙ ПРИ РАЗРЕШЕНИИ:
 ИНГ ДЛЯ ЛЕСНОГО ХОЗЯЙСТВА, СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ОТДЫХА ОТКРЫТЫЕ ПОМЕЩЕНИЯ.52-А. «ПРОЕКТНАЯ ПЛОЩАДКА» ОЗНАЧАЕТ ЗЕМЛЮ, ВКЛЮЧЕННУЮ В ПРОЕКТ, НА КОТОРОЙ
 ПРИМЕНИМОЕ ОБЩЕЕ РУКОВОДСТВО ПО ИНТЕНСИВНОСТИ РАСЧЕТНО СОГЛАСНО
 ПУНКТ C ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ДЕСЯТОГО РАЗДЕЛА ВОСЕМСОТ ДЕВЯТЬ ИЗ ЭТОГО
 СТАТЬЯ.
   § 3. Абзац второй абзаца е подпункта 3 статьи 805 Закона
 исполнительный закон с поправками, внесенными главой 348 законов 1973 г., является
 исправлено следующим образом:
   (2) Цели, политика и задачи. Основная цель и задача
 сельскохозяйственных угодий должно обеспечивать и поощрять использование земель в сельской местности.
 которые совместимы и совместимы с относительно низкой толерантностью
 природные ресурсы территорий и сохранение открытых пространств

 С.1145 3
 
 которые необходимы и составляют основу уникального характера парка. Anoth-
 Ее цель - предотвратить развитие полосы вдоль
 основные коридоры для путешествий, чтобы улучшить эстетический и экономический
 извлекают выгоду из парковой атмосферы вдоль этих коридоров.
   Жилая застройка и связанная с ней застройка и использование должны происходить
 [на крупных партиях или] в относительно небольших группах на тщательно отобранных
 и хорошо продуманные сайты. Это обеспечит дальнейшее разнообразие в
 жилые и связанные возможности развития в парке.§ 4. Абзац второй абзаца ж подпункта 3 статьи 805
 исполнительный закон с поправками, внесенными главой 348 законов 1973 г., является
 исправлено следующим образом:
   (2) Цели, политика и задачи. Основные цели и задачи
 Области управления ресурсами должны защищать хрупкие физические
 и биологических ресурсов, поощряют надлежащее и экономичное управление
 лесные, сельскохозяйственные и рекреационные ресурсы и сохранить открытые
 пространства, которые необходимы и составляют основу уникального характера парка.Еще одна цель этих участков - предотвратить развитие полосы вдоль
 основные коридоры для путешествий, чтобы улучшить эстетический и экономический
 выгоды, полученные от парковой атмосферы вдоль этих коридоров.
   [Наконец, районы управления ресурсами позволят жилые] RESI-
 СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЕ ОБСЛУЖИВАНИЕ [на значительных площадях или] И СВЯЗАННОЕ РАЗВИТИЕ
 И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДОЛЖНО ПРОИЗВОДИТЬСЯ в ОТНОСИТЕЛЬНО небольших кластерах на тщательно отобранных
 и хорошо продуманные сайты.
   § 5. В статью 809 Закона об исполнительной власти внесены изменения:
 подраздел 11-а изложить в следующей редакции:
   11-А.ВСЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ПО СОХРАНЕНИЮ БУДУТ РАССМОТРЕНЫ В СООТВЕТСТВИИ С ЭТОМ.
 ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ. A. (1) ЗАЯВИТЕЛЬ ПРЕДСТАВЛЯЕТ АГЕНТСТВУ:
   (I) ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБЪЕКТА, ИЗУЧАЮЩИЙ ПРИРОДНЫЙ
 РЕСУРСЫ ПЛОЩАДКИ ПРОЕКТА И ПРИЛЕГАЮЩИХ ЗЕМЕЛЬ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ ТЕКУЩИЕ
 МЕСТНЫЕ И РЕГИОНАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ВЫВОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, ВКЛЮЧАЯ ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ
 СОЗДАНИЕ И КАРТА ВАЖНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЗОН;
   (II) ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НА МЕСТЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВАЖНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ
 ОБЛАСТИ И ДРУГИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ САЙТА, ​​ОТНОСЯЩИЕСЯ К РАЗРАБОТКЕ.
 АТИОНЫ; А ТАКЖЕ
   (III) КОНЦЕПЦИЯ ПРОЕКТА, ОСНОВАННАЯ НА ДАННЫХ, УКАЗАННЫХ В
 СТАТЬИ (I) И (II) НАСТОЯЩЕГО ПОДПАРАГРАФА, КОТОРЫЕ УМЕНЬШАЮТ ПЛОЩАДЬ
 ПРОЕКТ, ПОДВЕРГАЕМЫЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИМ НАРУШЕНИЯМ, ЗАЩИЩАЕТ ВАЖНЫЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ
 РАЙОНОВ, СОДЕЙСТВУЮЩИХ КЛАСТЕРИРОВАНИЮ ТАКИХ, ЧТО ЗОНЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРЕВЫШАЮТ
 НАСКОЛЬКО ВОЗМОЖНО, УЧИТЫВАЕТ СУЩЕСТВУЮЩЕЕ ОТКРЫТОЕ ПРОСТРАНСТВО И
 ЗОНЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ НА СЛЕДУЮЩИЕ СВОЙСТВА И ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ ОБЛАСТИ
 РАЗРАБОТКИ, ИМЕЮЩИЕ СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ПОЧВЫ И СКЛОНЫ.(2) АГЕНТСТВО ОБЯЗАНО ПРОВЕДИТЬ ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ПОСЕЩЕНИЕ САЙТА ДЛЯ ДОСТУПА К НАТУРАЛЬНЫМ
 РЕСУРСЫ И ОСОБЕННОСТИ САЙТА.
   (3) АГЕНТСТВО ОБЕСПЕЧИВАЕТ ПЕРИОД ОБЩЕСТВЕННОГО КОММЕНТАРИИ И ДЕРЖАТЬ
 ОБЩЕСТВЕННОЕ СОБРАНИЕ ПО ОБЩЕСТВЕННОМУ УВЕДОМЛЕНИЮ ОТНОСИТЕЛЬНО ИСХОДНЫХ ДАННЫХ И КОНЦЕПЦИИ
 ПЛАН.
   (4) АГЕНТСТВО УКАЗЫВАЕТ ЗАЯВИТЕЛЮ ЛЮБОЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
 ПЛОЩАДКА ПРОЕКТА, НЕОБХОДИМАЯ ДЛЯ ЗАВЕРШЕНИЯ ОКОНЧАТЕЛЬНОГО ЭКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПЛОЩАДКИ
 И УКАЗАТЬ ЛЮБЫЕ ДРУГИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ИНФОРМАЦИИ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К РАЗРАБОТКЕ-
 Ментальные соображения.АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБЪЕКТА, СООТВЕТСТВУЮЩИЙ В ПАРАМЕТРАХ
 ГРАФИК B ДАННОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ АГЕНТСТВУ ДЛЯ
 ОДОБРЕНИЕ.
   (5) ЗАЯВИТЕЛЬ ДОЛЖЕН ПОДГОТОВИТЬ ПЛАН ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ, КОТОРЫЙ
 ВКЛЮЧАЮТ ГРАНИЦЫ ПОСЫЛКИ И КОНВЕРТЫ РАЗВИТИЯ, РАСПОЛОЖЕНИЕ
 ОТКРЫТОЕ ПРОСТРАНСТВО И ПРОЕКТ ПЛАНА УПРАВЛЕНИЯ И СТРАХОВАНИЯ ОТКРЫТЫМ ПРОСТРАНСТВАМИ. ВСЕ
 ПЛАНЫ БУДУТ ОСНОВАНЫ НА УТВЕРЖДЕННОМ АНАЛИЗЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛОЩАДКИ И

 С. 1145 4
 
 ДРУГИЕ РЕСУРСЫ САЙТА, ​​ОТНОСЯЩИЕСЯ К СООБРАЖЕНИЯМ РАЗВИТИЯ.НА
 ПРЕДСТАВЛЕНИЕ НАСТОЯЩИХ ПЛАНОВ, ПРИНЯТОЕ АГЕНТСТВОМ, ЗАЯВКА
 ПРОЦЕСС РАССМОТРЕНИЯ ПОДРАЗДЕЛЕНИЙ ВТОРОЙ, ТРЕТЬЕ, ЧЕТВЕРТОЙ, ПЯТЫЙ И ШЕСТОЙ
 ЭТОГО РАЗДЕЛА НАЧИНАЕТСЯ. АГЕНТСТВО МОЖЕТ ЗАПРОСИТЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНУЮ ИНФОРМАЦИЮ-
 СВЯЗЬ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРЕДЛАГАЕМОГО ПЛАНА ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ И ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА
 ПЛАН УПРАВЛЕНИЯ И ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ И МОЖЕТ ТРЕБУЕТСЯ ПЕРЕСМОТР ПЛАНОВ
 ПРЕЖДЕ ЧЕМ ЗАЯВИТЬ ЗАЯВКУ ЗАПОЛНЕННОЙ.
   (6) НИКАКОЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ ПО СОХРАНЕНИЮ НЕ ДОЛЖНО БЫТЬ УТВЕРЖДЕНО, ЕСЛИ (I) НЕ НАЙДЕТ-
 ИНГ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЕСЯТЫМ ПОДРАЗДЕЛЕНИЯМ ЭТОГО РАЗДЕЛА, ПРОИЗВОДИТСЯ, И (II)
 ВЛАДЕНИЕ, НАСТРОЙКА, ЗАЩИТА, СОВМЕСТИМОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И УПРАВЛЕНИЕ
 НАЗНАЧЕННОЕ ОТКРЫТОЕ ПРОСТРАНСТВО ОСНОВАНО НА АНАЛИЗЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МЕСТА, И
 ВКЛЮЧАЕТСЯ В ПЛАН УПРАВЛЕНИЯ ОТКРЫТЫМИ ПРОСТРАНСТВАМИ И СТЕПЕНЬ И ИНОСТРАННОСТЬ
 ПОРИРОВАНО В РАЗРЕШЕННЫХ УСЛОВИЯХ.(7) АГЕНТСТВО МОЖЕТ ПРЕДОСТАВИТЬ ПРАВИЛАМИ ОТЛИЧИЯ ОТ КОНКРЕТНЫХ
 ТРЕБОВАНИЯ К СОХРАНЕНИЮ РАЗВИТИЯ, ЕСЛИ ОН ОПРЕДЕЛЯЕТ, ЧТО ТАКОЕ
 ТРЕБОВАНИЯ ВЫЗЫВАЛИ НЕОБХОДИМЫЕ ЭКОНОМИЧЕСКИЕ ТРУДНОСТИ, И НЕ ТРЕБУЮТСЯ
 ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ПЛОЩАДКИ ПРОЕКТА.
   (8) АГЕНТСТВО ДОЛЖНО ИМЕТЬ ЗАЯВЛЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩИМ ГРАЖДАНСКИМ
 ДЕЙСТВИЕ ЛЮБЫЕ УСЛОВИЯ РАЗРЕШЕНИЯ, ОГРАНИЧЕНИЯ ДЕЙСТВИЙ, ОБЯЗАТЕЛЬСТВА, УСЛОВИЯ ИЛИ
 ДРУГИЕ ПОСТОЯННЫЕ СРЕДСТВА ЗАЩИТЫ ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА.
   Б. АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБЪЕКТА ДОЛЖЕН РАССМАТРИВАТЬ СЛЕДУЮЩИЕ СООБЩЕНИЯ:
 АТИОНЫ:
   (1) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАЖНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ И ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ
 ПЛОЩАДКА ПРОЕКТА, ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЯ, ОБИТАНИЯ, БОЛОТНИКИ, НАВОДНЕНИЯ-
 РАВНИНЫ, ЕСТЕСТВЕННЫЕ ДРЕНАЖНЫЕ ПУТИ И УКЛОННЫЕ УЧАСТКИ;
   (2) НАЗЕМНАЯ И ВОДНАЯ ДИКАЯ ЖИЗНЬ, ОБИТАНИЕ, РАЗМЕДЛЕНИЕ,
 ПЕРЕМЕЩЕНИЕ, ПУТЕШЕСТВИЕ ИЛИ Иное ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТА ПРОЕКТА;
   (3) КОРИДОРЫ, ВКЛЮЧАЯ РЕЙДЖИНЫ И ПРИБРЕЖНЫЕ ЗОНЫ, ОБЕСПЕЧЕНИЕ
 СРЕДСТВА, КОТОРЫЕ МОГУТ ПУТЕШЕСТВОВАТЬ В СМЕЖНЫЕ ИЛИ НЕПРЕРЫВНЫЕ ТЕРРИТОРИИ
 ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ СРЕДА ОБИТАНИЯ, НЕРЕСТОВЫХ ТЕРРИТОРИЙ ИЛИ УЧЕТ ДРУГИХ ПОТРЕБНОСТЕЙ;
   (4) РАСТИТЕЛЬНЫЕ БУФЕРЫ НА БЕРЕГОВАХ ОЗЕР, ПРУДОВ, РЕК И
 ПОТОКИ И ЗАЩИТА И СОХРАНЕНИЕ ВЕРНАЛЬНЫХ БАССЕЙНОВ И ПРИБРЕЖНЫХ СРЕДСТВ
 ОБЛАСТИ;
   (5) БОЛЬШИЕ ПОВРЕЖДЕННЫЕ ЛЕСНЫЕ ТРАКТЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ДИКОЙ ПРИРОДЫ И
 БИОРАЗНООБРАЗИЕ, ОСОБЕННО ДЛЯ ЗАЩИТЫ РОДНЫХ ИЛИ ДРУГИХ ВИДОВ
 РАЗУМНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К ТАКИМ ТРАКТАМ; ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ ВОДОЙ И ДЛЯ MITI-
 ЗАЩИТА ИЗМЕНЕНИЯ КЛИМАТА, РАЗРЕШАЮЩАЯ ЛЕСНОЕ, СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО И
 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТДЫХА;
   (6) МИНИМИЗАЦИЯ СОЗДАНИЯ РУЧНЫХ И ЗАКАЛЕННЫХ КРАЙ МЕЖДУ
 ЛЕСНЫЕ ДОРОГИ, ДОРОГИ И ДРУГИЕ ОТКРЫТЫЕ ПЛОЩАДКИ И ДЛИНА ДОРОГ И
 ДОРОГИ;
   (7) РАЗМЕР, КОНФИГУРАЦИЯ И ПРЕДЛАГАЕМОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТА ПРОЕКТА ДЛЯ
 СОХРАНЯТЬСЯ ПОСТОЯННЫМИ ЮРИДИЧЕСКИМИ СРЕДСТВАМИ, ПРИ РАЗРЕШЕНИИ ОТДЫХА,
 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕСНОГО И СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА НА ВЫДЕЛЕННЫХ ОТКРЫТЫХ ПОМЕЩЕНИЯХ.C. ПРЕДНАЗНАЧЕННОЕ ОТКРЫТОЕ ПРОСТРАНСТВО ДОЛЖНО БЫТЬ В МАКСИМАЛЬНО ВОЗМОЖНОМ ОБЪЕМЕ:
   (1) НАХОДИТСЯ ЗА ГРАНИЦАМИ ВСЕХ ЛОТОВ, ПОСЫЛКОВ ИЛИ УЧАСТКОВ ДЛЯ
 РАЗРАБОТКА И РАЗРАБОТАННАЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЭКОЛОГИИ И ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА
 ПАРК; А ТАКЖЕ
   (2) НАСТРОЕНО ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДАННЫХ КОНСТРУКЦИОННЫХ ФАКТОРОВ:
   (I) ВКЛЮЧАЙТЕ ВАЖНЫЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЛАСТИ СОБСТВЕННОСТИ НА ОСНОВЕ
 УТВЕРЖДЕННЫЙ АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛОЩАДКИ;
   (II) ОБЕСПЕЧИВАЙТЕ ПОДКЛЮЧЕНИЕ К ЛЮБЫМ СЛЕДУЮЩИМ РАЙОНАМ ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА,
 ДРУГИЕ Охраняемые территории, рабочие леса и сельское хозяйство;
   (III) НЕ РАЗДЕЛЕНИЕ НА ДОРОГИ ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ, ПОДЪЕЗДНЫЕ ДОРОГИ ИЛИ ДРУГИЕ ПЕРМЫ.
 ОСОБЕННОСТИ ФРАГМЕНТАЦИИ NENT РУЧНОЙ РАБОТЫ;

 С.1145 5
 
   (IV) СОЗДАЙТЕ ОДИН БОЛЬШОЙ, НЕПРЕРЫВНЫЙ ПЛОЩАДЬ, А НЕ МНОГИЕ МАЛЕНЬКИЕ ПЛОЩАДКИ.
 ЕСЛИ БОЛЬШИЕ ПЛОЩАДКИ НЕОБХОДИМЫ, ЧЕМ НЕМНОГО МЕНЬШЕ, ВАЖНО ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ
 КАЛИБРОВЫЕ ОБЛАСТИ САЙТА МОГУТ БЫТЬ ЗАЩИЩЕНЫ ПРИ ПОДКЛЮЧЕНИИ КОРИДОРОВ
 СОСТОИТ ИЗ ПРИРОДНОЙ ЗЕМЛИ ШИРИНОЙ НЕ МЕНЕЕ ТРИ СОТНИ
 ТРИДЦАТЬ ФУТОВ; А ТАКЖЕ
   (V) МИНИМИЗИРУЙТЕ ОТНОШЕНИЕ КРАЙНОЙ ПЛОЩАДИ ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА И СДЕЛАЙТЕ ЕГО КАК
 ЕДИНАЯ, КАК ВОЗМОЖНАЯ.
   D. (1) МИНИМАЛЬНОЕ ОТКРЫТОЕ ПРОСТРАНСТВО, НЕОБХОДИМОЕ В ОХРАННОМ ПОДРАЗДЕЛЕНИИ
 ЯВЛЯЕТСЯ:
   (I) В ЗОНАХ НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ, СОРОК ПРОЦЕНТОВ УЧАСТКА ПРОЕКТА.ЕСЛИ
 ДИЗАЙН ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА ДОСТИГАЕТ ШЕСТЬДЕСЯТ ПРОЦЕНТОВ, МОЖЕТ БЫТЬ РАЗРЕШЕНО ДЕСЯТЬ
 БОНУС ПРОЦЕНТНОЙ ПЛОТНОСТИ. ЕСЛИ ОНА ДОСТИГАЕТ СЕМЬДЕСЯТ ПРОЦЕНТОВ, МОЖЕТ БЫТЬ
 РАЗРЕШАЕТСЯ БОНУС НА ДВАДЦАТЬ ПРОЦЕНТОВ ПЛОТНОСТИ.
   (II) В СЕЛЬСКИХ ЗОНАХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ, ПЯТЬДЕСЯТ ПЯТЬ ПРОЦЕНТОВ ПЛОЩАДКИ ПРОЕКТА. ЕСЛИ
 ДИЗАЙН ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА ДОСТИГАЕТ СЕМЬДЕСЯТ ПРОЦЕНТОВ, МОГУТ БЫТЬ РАЗРЕШЕНЫ
 БОНУС ДЕСЯТИ ПРОЦЕНТОВ ПЛОТНОСТИ. ЕСЛИ ОНА ДОСТИГАЕТ ВОСЕМЬДЕСЯТ ПРОЦЕНТОВ, МОЖЕТ БЫТЬ
 РАЗРЕШАЕТСЯ БОНУС НА ДВАДЦАТЬ ПРОЦЕНТОВ ПЛОТНОСТИ.
   (III) В ОБЛАСТИ УПРАВЛЕНИЯ РЕСУРСАМИ СЕМЬДЕСЯТ ПЯТЬ ПРОЦЕНТОВ ОТ
 САЙТ ПРОЕКТА.ЕСЛИ ДИЗАЙН ОТКРЫТОГО ПРОСТРАНСТВА ДОСТИГАЕТ ВОСЕМЬДЕСЯТ ПЯТИ ПРОЦЕНТОВ,
 МОЖЕТ БЫТЬ РАЗРЕШЕН ДЕСЯТИПРОЦЕНТНЫЙ БОНУС ПЛОТНОСТИ. ЕСЛИ ДОСТИГАЕТ ДЕВЯТЬ
 ПРОЦЕНТ, МОЖЕТ БЫТЬ РАЗРЕШЕН БОНУС ПЛОТНОСТИ ДВАДЦАТЬ ПРОЦЕНТОВ.
   (2) ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАСЧЕТНОЙ ПЛОТНОСТИ БОНУСА НЕ ГАРАНТИРУЕТСЯ И
 ПОДЛЕЖИТ ПРОВЕРКЕ АГЕНТСТВА. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ОСНОВНЫЕ ЗДАНИЯ МОГУТ БЫТЬ
 НАХОДЯЩИЕСЯ НА САЙТЕ ПРОЕКТА ИЛИ В ТАКОМ НЕПОСРЕДСТВЕННО НЕПРЕРЫВНОМ
 ПЛОЩАДЬ ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ, СОГЛАСНО ПУНКТУ C ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ДЕСЯТОГО ЭТОГО
 РАЗДЕЛ.ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ОСНОВНЫЕ ЗДАНИЯ МОГУТ БЫТЬ РАЗРЕШЕНЫ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В
 ОДИНАКОВАЯ, НО НЕПОСТОЯННАЯ ЗЕМЕЛЬПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКАЯ ПЛОЩАДЬ, ЕСЛИ НАХОДИТСЯ В ОДНОМ ГОРОДЕ.
 ДАННЫЙ БОНУС НЕ МОЖЕТ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ НИКАКИМ ОБРАЗОМ, КРОМЕ АГЕНТСТВА.
 РАЗРЕШИТЬ И ТОЛЬКО ЕСЛИ ВСЕ ТРЕБУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДЕСЯТОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ ЭТОГО
 РАЗДЕЛ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ РАЗМЕЩЕНИЯ ЗДАНИЙ И ДРУГИХ ИНФРАСТРУКТУР.
 ТРУКТУРА.
   § 6. В статью 809 исполнительного закона внесены три новых
 подразделы 16, 17 и 18 изложить в следующей редакции:
   16. НИЧТО В ЭТОМ РАЗДЕЛЕ НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕНО ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ АГЕНТСТВА
 ТРЕБОВАНИЕ ЛЮБОГО ЮРИСДИКЦИОННОГО ПРОЕКТА СОГЛАСНО ВОСЕМЬСОТНОМУ РАЗДЕЛУ
 ДЕСЯТЬ ЭТОЙ СТАТЬИ БУДЕТ РАЗРАБОТАНО В СООТВЕТСТВИИ С ЭКОЛОГИЧЕСКИМ УЧАСТКОМ
 АНАЛИЗ И РАЗРАБОТКА В ЦЕЛЯХ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОХРАНЕНИЯ И
 ПЛАН СТРАХОВАНИЯ И ОБЕСПЕЧИТЬ СОХРАНЕНИЕ ЧАСТИ
 ПЛОЩАДКА ПРОЕКТА НА ОТКРЫТОМ ПРОСТРАНСТВЕ ПО ОГРАНИЧЕНИЮ ДЕЙСТВИЯ, УСЛОВИЯМ ИЛИ ДРУГИМ ЮРИДИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ
 СРЕДСТВА.17. ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ РАЗРЕШЕНИЯ НА ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ СОХРАНЕНИЯ
 ТРЕБУЕМЫЕ СОГЛАСНО ДАННОЙ СТАТЬЕ АГЕНТСТВО НЕ РАССМАТРИВАЕТ
 ЛОТЫ ЗАКОННО СОЗДАНЫ ДО ДАТЫ ДАННОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ.
 НИЧТО В ДАННОМ ПОДРАЗДЕЛЕНИИ НЕ ВЛИЯЕТ НА ВОЗМОЖНОСТИ АГЕНТСТВА
 РАЗРЕШЕНИЕ ИЛИ ЛЮБОЕ ЕГО ПРОДЛЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРОКА ВРЕМЕНИ
 КОТОРОЕ РАЗРЕШЕННОЕ ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ БУДЕТ СЧИТАТЬСЯ «СУЩЕСТВУЮЩИМ», как определено
 В ПОДРАЗДЕЛЕНИИ ДВАДЦАТЬ ПЯТЬ ИЗ РАЗДЕЛА ВОСЕМЬСОСТА ДВА ЭТОЙ СТАТЬИ.18. НИЧТО В ЭТОМ РАЗДЕЛЕ НЕ ДОЛЖНО СОЗДАТЬ УПОЛНОМОЧИВАЮЩЕЕ АГЕНТСТВО.
 ПОТРЕБОВАТЬ, ЧТО ЛЮБАЯ ИНТЕРЕСНАЯ ЗЕМЛЯ, СОСТАВЛЯЮЩАЯ ЧАСТЬ СОХРАНЕНИЯ
 ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ ПЕРЕДАВАЕТСЯ ГОСУДАРСТВЕННОМУ ОРГАНУ ИЛИ ЛЮБОМ ДРУОМУ ЮРИДИЧЕСКОМУ ЛИЦУ,
 ЕСЛИ ЗАЯВИТЕЛЬ ТАК ПРЕДЛОЖИТ И ДРУГОЕ ЮРИДИЧЕСКОЕ ЛИЦО НЕ СОГЛАСНО.
   § 7. Абзац 3 абзаца г подпункта 1 статьи 810 Закона
 исполнительный закон, добавленный главой 348 законов 1973 г., является
 исправлено следующим образом:

 С. 1145 6
 
   (3) Все виды землепользования и застройки, а также все подразделения земли.
 [двадцать] ДЕСЯТЬ или более жилых участков, участков или участков или жилых домов-
 стандартные блоки, независимо от того, предназначены ли они для постоянного, сезонного или временного использования.§ 8. Абзац 3 абзаца в части 1 статьи 810 Закона
 исполнительный закон, добавленный главой 348 законов 1973 г., является
 исправлено следующим образом:
   (3) Все виды землепользования и застройки, а также все подразделения земли.
 ing [тридцать пять] ДВАДЦАТЬ ПЯТЬ или более жилых участков, участков или участков
 или жилых единиц, независимо от того, предназначены ли они для постоянного, сезонного или трансграничного
 разумное использование.
   § 9. Подпункт 1 пункта б и подпункт 1 пункта в
 части 2 статьи 810 Закона об исполнительной власти с дополнениями гл.
 тер 348 законов 1973 г. изменены следующим образом:
   (1) Подразделения земли (и все связанные с землепользованием и застройкой
 к нему) с участием [десяти] ПЯТИ или более, но менее [тридцати пяти] ДВЕНЬ-
 TY-FIVE участков, участков или участков, кроме участков земли, в которые вовлечены
 ing дома на колесах.(1) Подразделения земли (и все связанные с землепользованием и застройкой
 к нему) с участием пяти или более, но менее [двадцати] ДЕСЯТИ лотов, посылок
 или участки, кроме участков земли с участием передвижных домов.
   § 10. Ничто в этом акте не должно толковаться как разрешающее Adiron-
 агентство Dack Park потребовать, чтобы любой интерес к земле, входящей в
 природоохранное подразделение должно быть передано государственному органу или любому другому
 юридическое лицо.
   § 11. Настоящий акт вступает в силу на сто восьмидесятый день.
 после того, как это станет законом.