Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение
«Детский сад № 17»
Конспект
образовательной деятельности
по художественно – эстетическому развитию (аппликация)
нетрадиционная техника
на тему: «Колосок»
подготовительная к школе группа
Старший воспитатель: Тихонова Е.Л. Воспитатели: Потапенко А.Ю. Тихонова Н.С. |
Новокузнецк
2020г.
Конспект образовательной деятельности
по художественно – эстетическому развитию (аппликация)
нетрадиционная техника на тему: «Колосок»
подготовительная к школе группа
Цель: познакомить детей с новым нетрадиционным способом аппликации, из макаронных изделий.
Задачи:
Образовательные:
Развивающие:
Воспитательные:
Демонстрационный материал: ваза с колосьями ржи и пшеницы, иллюстрации колосков, поля, комбайна, хлебобулочных изделий.
Раздаточный материал
– цветной картон
– клей ПВА
– макаронные изделия
– салфетки
– клеенки.
Предшествующая работа: просмотр фильма «Путь хлеба», лепка и выпечка из теста хлеба в хлебопечке и каравая в духовке. Знакомство с различной техникой, которая участвует в посеве, уборке, перемалывании и т. д. будущих хлебобулочных изделий. Знакомство с профессиями: пекарь, тестовод, формовщик, укладчик, упаковщик, агроном, тракторист, комбайнер, водитель. Рассматривание коллекции макаронных изделий.
Ход занятия:
Организационный момент
Воспитатель – Отгадайте загадку:
Мы порой как будто ушки,
Бантики, рожки, ракушки.
Любят взрослые и дети
И колечки, и спагетти.
А добавь в нас тертый сыр –
Будет настоящий пир.
Совершенно верно, это – макароны. Помните, мы с Вами рассматривали нашу коллекцию. Каких там только нет макаронных изделий?
Воспитатель демонстрирует детям различные виды макарон, поочередно доставая их из волшебного мешочка.
Воспитатель: Ребята, а какие макароны вам понравились?
Дети: В виде бантиков, шоколадные и. т. д.
Воспитатель: Потрогайте их пальчиками. Какие они на ощупь?
Дети: твердые, круглые…
Воспитатель: Умницы.
Организационно-поисковый этап.
Воспитатель: Ребята, а как вы понимаете, что такое макароны?
Дети: это высушенное тесто в виде трубочек.
Воспитатель: верно, а что является основным составом для макарон, из чего они состоят?
Дети: из пшеничной муки.
Воспитатель: хорошо. А какие макаронные изделия вы знаете?
Дети: рожки, ракушки, гребешки, спагетти, улитки…
Воспитатель: А знаете ли вы что, макароны используют не только в пищу, но и делают из них различные поделки?
Дети: Да.
Воспитатель: Сегодня, я предлагаю Вам сделать необычную аппликацию колоска, используя различные виды макаронных изделий. Хотите?
Дети: Да, очень.
Воспитатель: Посмотрите, какой колосок сделала я (показывает эскиз колоска).
Воспитатель: Вам нравится? Красиво? Давайте и мы сделаем такие колоски и оформим поле из колосков.
Дети: Давайте.
Воспитатель: У вас на столах стоят макаронные изделия, из которых мы будем делать колоски, клей, кисточка для клея, формочка для клея, салфетка, картон оранжевого цвета, он будет нашим полем. Но перед тем как вы начнете, я предлагаю поиграть.
Физминутка:
Вырос в поле колосок, (Дети сидят на корточках)
Он не низок, не высок. (Постепенно поднимаются)
Налетел ветерок, (Поднимают руки вверх, качают)
Закачался колосок. Мы в поле придем, (Ходьба на месте)
Колоски соберем, (Наклон)
Муки натолчем, (Кулаком одной руки стучат по ладони другой)
Каравай испечем, (Сжимают кисти рук)
Гостей приглашаем, Караваем угощаем. (Вытягивают руки вперед, ладони вверх) Воспитатель: А сейчас я предлагаю приступить к работе и создать свой колосок.
(Воспитатель напоминает о правилах работы с клеем, обращает внимание на расположение аппликации на фоне и прочности крепления материала. Под приятную музыку дети занимаются продуктивной деятельностью, в процессе работы воспитатель помогает советом и показом, если нужно).
Рефлексивно-корригирующий этап.
Воспитатель: Что мы с Вами сегодня делали? Вам понравилось занятие? Сейчас мы устроим выставку из работ и полюбуемся нашим полем, но сначала приберите на своих рабочих местах.
(Дети вместе с воспитателем размещают свои работы на стенде. Выражают свои эмоции. Самостоятельно убирают своё рабочее место).
Воспитатель: Я благодарю каждого за хорошую работу!
Елена Лисейкина
Конспект НОД по аппликации «Золотые колосья хлеба»
Конспект НОД по художественному творчеству
Цель занятия: формировать умение детей вырезать овал из прямоугольника путем срезания уголков.
Задачи:
1. Познакомить детей с особенностями строения колоса;
2. Вспомнить правила безопасного использования ножниц;
3. Продолжать учить детей путем срезания уголков прямоугольника получать овал;
4. Закреплять приемы аккуратного наклеивания;
5. Развивать усидчивость, умение доводить начатое дело до конца.
Тип занятия: комбинированное.
Форма занятия: фронтальная и индивидуальная
Продолжительность: 25 мин
Участники: воспитатель и дети.
Возраст обучающихся: дети 6-ого года жизни
Оборудование и материалы:
Предварительная подготовка: беседа с детьми на тему «Хлеб — всему голова»
Методы и приемы работы с детьми: объяснение, рассказ, беседа, демонстрация наглядных пособий, физминука, самостоятельная деятельность детей, использование художественной литературы.
1. Вводная часть 3 мин.
а) чтение стихотворения Е. Кравченко «Чудесный колосок»;
б) рассматривание колосьев ржи;
2. Основная часть 20 мин.
а) беседа о правилах работы с ножницами;
б) объяснение правила вырезания овала из прямоугольника путем срезания уголков;
в) объяснение вырезания усиков из длинной полоски бумаги;
д) вырезание овалов из прямоугольнико;
е) разрезание полосок по намеченным линиям;
з) наклеивание стебля, зерен и усиков.
3. Заключительная часть 2 мин.
а) рефлексия (что мы сегодня делали, что понравилось)
б) наведение порядка на рабочем месте.
1. Вводная част ь.
Воспитатель: Ознакомление детей с темой занятия. Чтение стихотворения Е. Кравченко «Чудесный колосок»
Расскажу тебе, дружок,
Про чудесный колосок.
Тот, что зреет на полях –
Попадёт на стол в хлебах.
Сушки, плюшки и батон –
Хлеб приходит в каждый дом.
Воспитатель: О чем это стихотворение?
Воспитатель: Что может получиться из колоска?
Дети: хлеб, сушки, плюшки, батон.
Воспитатель: А можем мы из одного колоска сделать много плюшек?
Дети: В одном колоске мало зернышек, а значит получиться мало муки.
Воспитатель: Давайте мы сегодня с вами сделаем много колосков. Вот посмотрите, какие они, какая форма у зернышек, какой цвет, как они расположены, их размер?
Дети рассматривают рисунки колоски ржи, трогают ручками и отмечают: форма зернышек овальная, цвет – желтый, светло коричневый, расположены — один за другим, размер – маленькие.
2. Основная част ь.
Воспитатель: Какие правила работы с ножницами мы знаем.
Дети: ножницами не махать, если они уже не нужны, то должны лежать на столе закрытыми, при необходимости передавать друг другу ножницы закрытыми, держа за лезвия.
Воспитатель: Давайте все вместе нарисуем овал в воздухе.
Дети: рисуют овал в воздухе.
Воспитатель: Напомню вам, как вырезать из прямоугольника овал: беру в правую руку ножницы, большой палец в одно кольцо ножниц, в другое кольцо средний палец, а указательный палец лежит сверху ножниц. Локти на столе. В левую руку беру заготовку, держу за большую сторону, и срезаю уголки. Концы ножниц должны быть направлены только от себя. Далее мы срезаем получившиеся уголки до той степени, пока у нас не получится овал.
Можете приступать к работе.
Дети: вырезают овалы из прямоугольников.
(Музыкальное сопровождение: звуки природы для релаксации «Весенние голоса»).
Все захлопали в ладоши
Застучали наши ножки
Громче и быстрее
По коленочкам ударим
Ручки, ручки поднимаем
Завертелись наши ручки,
Воспитатель: Зернышки мы вырезали, а теперь нам надо вырезать усики. Для этого, мы разрезаем 2 наших полосочки по намеченным линиям
Дети: Разрезают полоски на 5 частей.
Воспитатель: Теперь у нас все готово и мы начинаем приклеивать наши детели в следующей последовательности:
— стебель. Отступив от низ немного места посередине приклеиваем длинную полосочку – это стебель. Намазываем полоску клеем на клееночке, прикладываем на белый лист и прижимаем салфеткой.
— зерна. Примерно на середине стебля начинаем приклеивать наши зернышки. Размещаем их в шахматном порядке (первую приклеим с одной стороны, а второе зернышко с другой стороны немного выше, третье – там же где и первое зерно, но повыше второго и т. д.)
Дети: выполняют задание.
3. Завершающий эт ап.
Воспитатель: Давайте посмотрим на наши работы. Дети, колоски очень рады, что их стало так много. Они говорят вам спасибо. Давайте мы повесим наши работы вместе на выставку.
Воспитатель: Что мы сегодня делали?
Дети: Клеили колоски, вырезали из прямоугольника овалы.
Воспитатель: Что больше всего понравилось?
Дети высказывают свое мнение.
Воспитатель: А сейчас приводим в порядок рабочие места
Конспект НОД по рисованию «Уборка хлеба на Кубани» Модель образовательной деятельности Художественно-эстетическое развитие – рисование Казанцева А. В. Тема: «Уборка хлеба на Кубани». Целевые.
«Золотые одуванчики». Итоговая НОД во второй младшей группе Тема: «Золотые одуванчики» Цель: Формировать элементарные представления об одуванчике; воспитывать бережное отношение к растениям, учить.
Конспект НОД по аппликации «Веселый клоун» Тема «Веселый клоун» Интеграция образовательных областей: «Художественно-эстетическое развитие», «Речевое развитие». Виды детской деятельности:.Конспект НОД по аппликации Конспект ОД по аппликации во 2 младшей группе «Мой весёлый звонкий мяч» Разработала и правила воспитатель группы по зрению: Панкова Ирина.
Конспект НОД по аппликации на тему «Скворечник» Цель: Уточнить и расширить знания детей о сезонных весенних изменениях в живой и неживой природе. Познакомить с особенностями жизни скворцов.Конспект НОД по аппликации «Пасхальная открытка» Цель: изготовление пасхальной открытки для родителей. Задачи: Воспитательные — расширять представления о празднике Светлая Пасха — воспитывать.«Золотые рыбки». Конспект НОД с детьми старшего дошкольного возраста в рамках проекта «Творческая мастерская эбру-рисования» Конспект непосредственно образовательной деятельности с детьми старшего дошкольного возраста в образовательной области «Художественно-эстетическое.НОД «Путь хлеба к нашему столу» Тема : Путь хлеба к нашему столу Методы и приёмы реализации содержания: разгадывание загадок, обращение к личному опыту, показ слайдов,.
Конспект НОД по аппликации «Праздничная елочка» Конспект непосредственной образовательной деятельности в младшей группе детского сада Образовательная область: Художественно-эстетическое.
Источник: www.maam.ru
Воспитатель:
Ребята я вчера увидела страшное зрелище!
И решила поделиться с вами увиденным…
(просмотр ролика на youtube.com/ «Подростки играют хлебом в футбол»)
Воспитатель:
А что вы знаете о хлебе?
(ответы детей)
Воспитатель:
Ребята, когда я была в вашем возрасте, часто не доедала хлеб, а что бы этого не узнали взрослые, выбрасывала недоеденные кусочки в ведро для мусора. Но однажды услышала от своего деда, бывшего заключённого фашистского лагеря про то, каким хлебом их кормили в плену…
Я расскажу вам рецепт «Хлеба» фашистских концлагерей.
Дело в том, что гитлеровцы выпекали для русских военнопленных специальный «БРОД» по особому рецепту.
РЕЦЕПТ
отжимки сахарной свеклы – 40%,
отруби – 30%,
древесные опилки – 20%,
целлюлозная мука из листьев или соломы – 10%.
«Хлеб войны» не может оставить равнодушным ни одного человека, особенно того, кто испытал на себе страшные лишения в период войны — голод, холод, издевательства. А моему деду волею судьбы пришлось пройти эти мучения плена.
Физкультминутка:
Посадили мы зерно
Что же выйдет из него?
Дождик землю поливает,
Солнце нежно пригревает
Подрастает зёрнышко-
Потянулось к солнышку.
С ветерком оно играет,
Ветерок его качает,
К земле низко прижимает-
Вот как весело играет!
Потянулся наш росток,
Превратился в колосок.
Воспитатель:
Сейчас предлагаю совершить виртуальную экскурсию, что бы узнать всё о хлебе .
(просмотр презентации)
1 слайд
«Хлеб — всему голова»
2 слайд
Россия издавна славилась хлебом.
3 слайд
«Одно зерно горсть даёт»
Воспитатель:
А какие пословицы о хлебе вы знаете?
(дети рассказывают пословицы и поговорки о хлебе)
• Не трудиться — хлеба не добиться.
• Гречневая каша — матушка наша, а хлебец ржаной — отец наш родной.
• Плох обед, коли хлеба нет.
• Без сохи и бороны и царь хлеба не найдёт.
• Без хлеба и без каши ни во что и труды наши.
• Без хлеба и у воды худо жить.
• Без хлеба не обедают.
• Будет хлеб — будет и обед.
• В поле — по хлеб, в лес — по дрова.
• Глубже пахать, больше хлеба жевать.
• Горька работа, да хлеб сладок.
• Ешь пироги, хлеб береги.
• Захочешь есть — о хлебе заговоришь.
• Много снега — много хлеба.
• Не шуба греет, а хлеб.
• Не трудиться — хлеба не добиться.
• Хлебушко — калачу дедушка.
• Хлеб да вода — чем не еда?
• Хлеб да вода — богатырская еда.
• Хлеб всему голова.
7 слайд
Хлебные изделия не только вкусны, но и питательны. Хлеб мы едим каждый день, и он не приедается.
8 слайд
Как же его выращивают? Кого мы должны благодарить за хлеб на нашем столе? Кто знает, как называются люди, которые выращивают хлеб?
(ответы детей)
9 слайд
Отправимся в небольшое путешествие на поле.
10 слайд
Весной специальным трактором пашут землю и сеют пшеницу.
11 слайд
Солнце светит, дождик идет. Вскоре на полях, появляются зеленые ростки — всходы.
12 слайд
Летом вырастают колоски, а в них много-много зёрен.
13 слайд
Осенью пшеница созревает и колоски убирают машинами — комбайнами.
Источник: kladraz.ru
В старшей группе детского сада детишки обладают всеми необходимыми навыками для создания аппликаций в различной технике. Они хорошо владеют навыками работы с ножницами. Аппликация в старшей группе отличается композициями с интересными сюжетными линиями. Такие занятия помогут не только закрепить полученные навыки, но и развить зрительный контакт, научить красиво располагать детали на листе бумаги.
Для работы с детьми для всех аппликаций понадобятся:
Осень – пора прекрасных пейзажей. Если занятия выпали на это время года, можно выполнить с ребятами композицию грибы. В такой технике можно делать и фрукты.
Это будет аппликация из крупы, потому для нее понадобятся:
Для выполнения аппликации детишкам будет необходимо:
На тему хлеба можно предложить ребятам выполнить модульную аппликацию в технике оригами. Конспекты занятий по этой теме очень помогут воспитателю в процессе обучения. Таким образом можно сделать осенний ковер. Для аппликации ребятам понадобятся:
Ход работы:
Каждый колосок состоит из трех таких модулей. Верхний модуль получается путем сложения исходного напополам. Нижний – простым подгибанием кончика. Прикрепите стебель в основание колоска.
Соберите оставшиеся колоски. Они могут быть как частью композиции, так и самостоятельной подделкой.
С помощью пряжи в старшей группе детского садика можно сделать аппликацию замечательного мишки.
Для этого понадобятся:
Ребята должны самостоятельно выбрать подходящий фон, нарисовать на нем или обвести трафарет медведя, заполнить участки деталями из цветной бумаги, нарисовать недостающие элементы.
На тематику домашние животные можно сделать аппликацию овечек, пасущихся на пастбище.
Для этого понадобятся:
На листе белой бумаги детишки должны обвести шаблоны животных. Раскрасить их. Вырезать.
Из ваты скатываются маленькие плотные шарики.
Далее такими шариками заполняется вырезанная овечка.
Далее готовые животные приклеиваются на фон пастбища. Можно изобразить на нем любое время года (зима, весна, осень, лето).
Засушенные листья измельчаются.
Из коричневых салфеток делаются стволы для осенних деревьев.
Затем они приклеиваются на основу.
Из измельченных листьев делается крона для деревьев — одежда для растений.
Из иголок ели или сосны можно сделать траву.
Из ваты – облака.
Вот такая поделка получается в итоге:
Источник: dekormyhome.ru
«Хлеб — всему голова» — эту поговорку знает каждый взрослый человек на Земле. C малых лет родители учили детей не бросать хлеб на пол и не играть с ним. Но так как дети развиваются и хотят поиграть, почему бы им не сделать аппликацию на тему хлеба? Сделать ее будет не труднее, чем аппликацию на тему грибы или фрукты. Мы сделаем с детками колоски из бумаги и украсим их цветами трёх видов. Так как детки уже в старшей группе, мы добавим к данной аппликации простое оригами. Информация будет выдана в виде мастер-класса, поэтому никакие конспекты занятий вести не нужно – достаточно следовать простым иллюстрированным инструкциям.
1. Берём лист бумаги А4, который станет колоском, вырезаем 20 квадратов со сторонами 5, 25, оставшийся кусочек разрезаем на три части — это будет стебель колоска:
2. Один из квадратов кладём ромбом и сгибаем так, чтобы получился треугольник, после этого сгибаем этот треугольник ещё раз. После этого возвращаем в прошлый треугольник:
3. Загните острые углы наверх так, чтобы это было похоже на самолётик:
4. Кончики нашего «самолётика» подогните, теперь это похоже на сердечко. Или на жилетку косолапого мишки:
Колосок содержит 3 разные детали, однако, они получаются из того «сердечка», которое мы уже умеем изготавливать. Верхний модуль получается сложением основного модуля пополам, а нижний модуль – простым подгибанием кончика. Очень удобно, ведь если деталь не получается, ее всегда можно вернуть в исходное состояние. Засовываем стебелёк в основание колоска:
Собираем оставшийся колосочек. Он может быть не только частью задуманной композиции, но и самостоятельной поделкой на тему хлеб или осень:
На него понадобится 8 лепестков. Он может быть не только частью хлебной композиции, но и, к примеру, частью осеннего ковра из цветов.
1. Берём листок А4 другого цвета, проводим ту же самую процедуру по созданию основной части колоска. Приклеиваем их на клейкую бумагу:
2. В середине цветка наклейте 2 квадрата, чтобы получилась звёздочка. Если вам не нравится такая середина, вырежьте кружочек и приклейте его.
Он очень похож на те аппликации, что мы уже сделали, только лепесточков понадобится всего 5.
1. Берём третий лист А4, вырезаем те же квадратики 5,25.
2. Один любой уголок сгибаем к центру, противоположной стороной накрываем наш загнутый угол.
3. Нетронутые боковые стороны следует согнуть вверх, затем переверните лепесток.
4. Как и в колоске, верхние уголки загните вниз, скоро наш лепесток будет готов.
5. Подогните нижний угол два раза, затем переверните лепесток и наклейте на клейкую бумагу, сделайте это и с остальными лепестками.
Третий и последний цветок. Потребуется всего 4 детали для его выполнения.
1. Этот цветок взял в себя части второго цветка и колоска. Возьмите другого цвета лист А4. Повторяем до 3 пункта действия по изготовлению второго цветка. Но потом загибаем нижней угол и просовываем его в кармашек.
2. Нарежьте лист зелёной бумаги тонкими полосками и сделайте стебельки к цветочкам.
3. Последний штрих – это листья для цветов. И нам вновь понадобится основная деталь — «сердечко» колоска. Вы можете оставить деталь, как есть, и получить листья — сердечки или подогнуть краешки и сделать листья – треугольники.
4. Доклейте листики к стебелькам, и композиция готова.
Этот цветок замечательно подойдет как деталь одежды или часть внезапно расцветшего осеннего дерева.
Если у вас что-то не получилось – не расстраивайтесь! Даже испорченные детали аппликации можно куда-нибудь использовать. Неудавшийся колосок может стать лапкой жука, а лепесток цветка – ушком какого-нибудь домашнего животного. Главное – не бойтесь экспериментировать и у вас все получится!
Если вам и ребятам понравилось делать колосок, то почему бы вам не попробовать склеить или слепить что-нибудь еще? В этом вам помогут простые и понятные пошаговые видео:
Источник: webdiana.ru
Об авторе: Светлана Игоревна « Предыдущая запись Следующая запись »
Конспект НОД (лепка) в старшей группе по теме
«Колосок пшеницы»
Цель:развитие умения лепить колосок пшеницы методом пластилинографии;
Задачи: образовательные:
Расширять и углублять знание детей о пшеничном колоске, его внешнем виде;
Развивающие:
Развивать чувства композиции и колорита, творческие способности;
Воспитывающие:
Воспитывать интерес к изобразительной деятельности, любовь к природе.
1. Организационный момент:
Приход персонажа Мышки. Мышка просит собрать ей много колосков пшеницы на зиму.
2. Основная часть:
Воспитатель: ребята, давайте посмотрим на картинку, где изображено поле пшеницы. Что находится на колоске?
Дети: зерна.
(Воспитатель демонстрирует натуральный пшеничный колос)
– А зачем людям зерна?
– Расскажите, какой путь проходит колосок, чтобы получился хлеб?
Физминутка под музыку:
В землю зёрнышко попало.
(Дети присаживаются на корточки, прижимают голову к коленям и закрывают её руками)
Прорастать на солнце стало.
(Дети поднимают руки вверх над головой, приговаривая):
«Золотое солнышко, ты согрей нам зёрнышко! »
«Дождик, дождик, поливай! Будет хлеба урожай!»
(Дети вытягивают руки вперёд, ладонями вверх и «брызгают» на себя водой.)
Дождик землю поливал, и росточек подрастал!
(Дети медленно встают).
К свету и теплу тянулся (руки в стороны).
И красавцем обернулся (руки вперёд).
Золотые колоски на ветру качаются,
(Дети встают на носочки, поднимают прямые руки вверх, кисти рук опущены вниз).
Низко наклоняются.
(Дети машут поднятыми вверх руками и приговаривают):
«Поспел урожай! Приезжай, убирай!
(Наклоны вниз).
Воспитатель: Ребята, давайте присядем за стол и попробуем слепить колосок пшеницы методом пластилинографии.
Пальчиковая гимнастика:
Мышка зёрнышко нашла,
И на мельницу снесла.
Намолола там муки,
Испекла всем пирожки:
Мышонку – с капустой,
Мышонку – с картошкой,
Мышонку – с морковкой,
Мышонку – с морошкой.
Для большого толстячка –
Аж четыре пирожка:
С капустой, с картошкой, с морковкой, с морошкой.
3. Заключительная часть:
Итог занятия. Прощание с Мышкой. Рефлексия.
Адрес публикации: https://www.prodlenka.org/metodicheskie-razrabotki/166277-konspekt-nod-kolosok-pshenicy
Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение «Детский сад № 4п. Николаевка»
Конспект занятия в старшей группе
по аппликации на тему:
«Чудесный колосок»
Подготовила: воспитатель
Дубовик О.П.
2019 год
Цель: Изготовить с детьми объёмную аппликацию, с использованием тыквенных семян.
Задачи:
Обучающие:
Расширить и углубить знания детей о выращивании колосков пшеницы.
Расширить и углубить знание детей о пшеничном колосе, его внешнем виде. Систематизировать представления детей о труде людей, выращивающих хлеб.
Развивающие:
Закрепить приемы аккуратного наклеивания .
Развивать внимание, мелкую моторику, усидчивость, умение доводить начатое дело до конца.
Развивать мелкую моторику рук, чувство цвета и формы;
Воспитательные:
Воспитывать усидчивость и аккуратность в работе.
Воспитывать у детей бережное отношение к хлебу, уважение к труду хлебороба.
Оборудование:
Колоски пшеницы, иллюстрации с изображением людей выращивающих хлеб и машин, иллюстрации на тему «Хлеб всему голова» ,клей, салфетки, клеенки, цветной картон, кисть, краски, фломастеры, семена тыквы, зеленая бумага.
Предварительная работа: беседа с детьми на тему «Откуда хлеб на стол пришел», чтение сказки «Колосок» в обработке С. А. Могилевской, рассматривание иллюстраций на тему: «Хлебобулочные изделия», рассматривание иллюстраций о выращивании колосьев пшеницы Загадывание загадок о хлебе, колосьях, зерне. Чтение рассказов: Э.Шим «Хлеб растёт», С. Шуртаков «Зерно упало в землю», чтение сказки «Колосок» в обработке С. А. Могилевской », просмотр мультфильма: украинская народная сказки «Колосок»
Ход занятия:
Воспитатель: Вырос в поле дом,
Полон дом зерном
И стоит новый дом на столбе золотом.
Дети: Колос
Воспитатель: – Правильно, ребята! Колос растёт в поле, у него много зёрен, когда колос созревает, то становиться как будто жёлтое золото. Столб – это стебелёк. А у нас с вами есть настоящие колоски пшеницы. Послушайте стихотворение о колоске: Е. Кравченко «Чудесный колосок»)
Расскажу тебе, дружок,
Про чудесный колосок.
Тот, что зреет на полях –
Попадет на стол в хлебах.
Сушки, плюшки и батон –
Хлеб приходит в каждый дом.
Ребята, чтобы вырастить колосья для, этого нужны руки людей и много сил. Давайте вспомним, как трудятся люди и машины, чтобы вырастить колосья пшеницы перед тем, как хлеб» придет» к нам на стол. давайте поиграем в игру: Что зачем?»
(Воспитатель раскладывает на столе картинки с изображением разных этапов появления на столе хлеба: зернышко, трактор пашет землю, сеялка, пшеничное поле, комбайн убирает урожай, элеватор – помещение для хранения зерна, мука, хлеб)
– Посмотрите внимательно на карточки. Какую мы должны взять первую, почему?
(Дети выбирают карточки и дают объяснения, что люди делают сначала, а что потом: подготавливают поля для посева, зерна сеют в землю, из них вырастают колосья, их собирают, обмолачивают, получают зерна, из зерен делают муку, из муки пекут хлеб)
Физкультминутка:
«В землю зернышко попало»
В землю зернышко попало (дети приседают),
Прорастать на солнце стало (руки над головой).
Дождик землю поливал, и росточек подрастал (дети медленно встают).
К свету и теплу тянулся, и красавцем обернулся
2.Основная часть.
Воспитатель: Сегодня мы с вами сделаем свое поле, вырастим много таких чудесных колосков. Посмотрите на колоски, какие они, какая форма у зерен, какой цвет, как они расположены, их размер? (дети рассматривают колоски и отмечают: форма зернышек – овальная, цвет – желтый, расположены – один за другим, размер – маленькие ).
– Из чего состоит колосок? (стебелька, зернышек, усиков)
– Что нужно сделать, чтобы достать зернышки из колоска? (обмолотить)
Пальчиковая игра «Обмолоти колосок»:
Молотить мы стали
(указательный палец правой руки стучит по левой ладони)
Зерна все достали.
(поочередно соединяем большой палец на обеих руках с остальными)
1, 2, 3, – ты на зерна посмотри.
(три хлопка в ладони, руки вперед)
Воспитатель: – Пальчики мы к работе подготовили. Посмотрите на тарелочки, которые стоят перед вами на столе. Как вы думаете, что на них?
Дети: тыквенные зернышки, зеленая бумага.
Воспитатель: Правильно, это детали колоска. Из зеленой бумаги вырезаем тонкие стебли для колосков. Сперва необходимо выложить колос, стебель, зерна-тыквенные семечки, без использования клея (для того, чтобы дети имели представление о том, как должна выглядеть работа). Начинаем приклеивать наши детали :сначала стебель (отступив от низа немного, наклонно из нижнего левого угла в верхний правый угол приклеиваем длинную узкую полоску – это стебель ),потом зерна (сначала самое верхнее зернышко, потом приклеиваем другие : одно зернышко слева от стебелька, другое зернышко – напротив справа, следующее – там же где и первое, пониже и т.д.)
усики нарисуем желтым фломастером.
Воспитатель: Можете приступать к работе.
Рефлексия:
Посмотрите, какие красивые у вас получились колоски, а если собрать их все вместе, то получится поле из наших чудесных колосьев. Молодцы! Потрудились хорошо.
Вам понравилось делать колоски?
-Какие материалы вы использовали для их изготовления?
-Может быть, что-то вам показалось трудным?
-Как вы думаете, сможете вы изготовить такую аппликацию самостоятельно?
Колосья хлебные растут,
А в них зернышки живут.
Эти зерна непростые,
Они солнцем налитые.
«Хлеб – всему голова» – эту поговорку знает каждый взрослый человек на Земле. C малых лет родители учили детей не бросать хлеб на пол и не играть с ним. Но так как дети развиваются и хотят поиграть, почему бы им не сделать аппликацию на тему хлеба? Сделать ее будет не труднее, чем аппликацию на тему грибы или фрукты. Мы сделаем с детками колоски из бумаги и украсим их цветами трёх видов. Так как детки уже в старшей группе, мы добавим к данной аппликации простое оригами. Информация будет выдана в виде мастер-класса, поэтому никакие конспекты занятий вести не нужно – достаточно следовать простым иллюстрированным инструкциям.
1. Берём лист бумаги А4, который станет колоском, вырезаем 20 квадратов со сторонами 5, 25, оставшийся кусочек разрезаем на три части – это будет стебель колоска:
2. Один из квадратов кладём ромбом и сгибаем так, чтобы получился треугольник, после этого сгибаем этот треугольник ещё раз. После этого возвращаем в прошлый треугольник:
3. Загните острые углы наверх так, чтобы это было похоже на самолётик:
4. Кончики нашего «самолётика» подогните, теперь это похоже на сердечко. Или на жилетку косолапого мишки:
Колосок содержит 3 разные детали, однако, они получаются из того «сердечка», которое мы уже умеем изготавливать. Верхний модуль получается сложением основного модуля пополам, а нижний модуль – простым подгибанием кончика. Очень удобно, ведь если деталь не получается, ее всегда можно вернуть в исходное состояние. Засовываем стебелёк в основание колоска:
Собираем оставшийся колосочек. Он может быть не только частью задуманной композиции, но и самостоятельной поделкой на тему хлеб или осень:
На него понадобится 8 лепестков. Он может быть не только частью хлебной композиции, но и, к примеру, частью осеннего ковра из цветов.
1. Берём листок А4 другого цвета, проводим ту же самую процедуру по созданию основной части колоска. Приклеиваем их на клейкую бумагу:
2. В середине цветка наклейте 2 квадрата, чтобы получилась звёздочка. Если вам не нравится такая середина, вырежьте кружочек и приклейте его.
Он очень похож на те аппликации, что мы уже сделали, только лепесточков понадобится всего 5.
1. Берём третий лист А4, вырезаем те же квадратики 5,25.
2. Один любой уголок сгибаем к центру, противоположной стороной накрываем наш загнутый угол.
3. Нетронутые боковые стороны следует согнуть вверх, затем переверните лепесток.
4. Как и в колоске, верхние уголки загните вниз, скоро наш лепесток будет готов.
5. Подогните нижний угол два раза, затем переверните лепесток и наклейте на клейкую бумагу, сделайте это и с остальными лепестками.
Третий и последний цветок. Потребуется всего 4 детали для его выполнения.
1. Этот цветок взял в себя части второго цветка и колоска. Возьмите другого цвета лист А4. Повторяем до 3 пункта действия по изготовлению второго цветка. Но потом загибаем нижней угол и просовываем его в кармашек.
2. Нарежьте лист зелёной бумаги тонкими полосками и сделайте стебельки к цветочкам.
3. Последний штрих – это листья для цветов. И нам вновь понадобится основная деталь – «сердечко» колоска. Вы можете оставить деталь, как есть, и получить листья – сердечки или подогнуть краешки и сделать листья – треугольники.
4. Доклейте листики к стебелькам, и композиция готова.
Этот цветок замечательно подойдет как деталь одежды или часть внезапно расцветшего осеннего дерева.
Если у вас что-то не получилось – не расстраивайтесь! Даже испорченные детали аппликации можно куда-нибудь использовать. Неудавшийся колосок может стать лапкой жука, а лепесток цветка – ушком какого-нибудь домашнего животного. Главное – не бойтесь экспериментировать и у вас все получится!
Если вам и ребятам понравилось делать колосок, то почему бы вам не попробовать склеить или слепить что-нибудь еще? В этом вам помогут простые и понятные пошаговые видео:
Автор занятия: Давыдова Светлана Алексеевна, воспитатель-методист высшей квалификационной категории.
Выявить умение детей сравнивать предметы по величине (большой-маленький, высокий-низкий, длинный-короткий).
Определить уровень развития у детей представлений о форме и геометрических фигурах (круг, квадрат, треугольник, овал, прямоугольник).
Выявить умение детей отсчитывать заданное количество предметов и сравнивать совокупности этих предметов.
Выявить умение детей различать цифры от 1 до 5.
Определить уровень развития у детей пространственных представлений: влево, вправо, вверх, вниз, за, перед.
Определить умение детей устанавливать последовательность событий.
Уточнить знания детей о хлебе.
Словарь: хлебушек, хлебобулочные продукты, машина-хлебовоз.
Закрепить знания о цветах: зеленый, желтый, оранжевый.
Формировать умение внимательно слушать и выполнять словесную инструкцию воспитателя.
Упражнять в аккуратном наклеивании.
Развивать образное воображение, логическое мышление, память, общую и мелкую моторику.
Воспитывать бережное отношение к хлебу.
Поднос с хлебобулочными изделиями.
Листы бумаги с нарисованными тремя колосками разной величины.
Цветные карандаши.
Демонстрационные картинки: колосья, зерно, мука, тесто, хлеб.
Раздаточные листы с изображением города, вырезанная из картона машина-хлебовоз.
Вырезанные из картона «батоны».
Наборные полоски разной длины.
Нарисованные блюда различной формы ( круглой, овальной, квадратной, треугольной), вырезанные из цветной бумаги силуэты хлеба, бублика, батона, пирожка, лаваша.
Оборудование для аппликации.
Ребята, посмотрите, что я принесла вам? (Показ). Назовите эти продукты. (Ответы детей). Хлеб, батон, бублик, пирожок, лаваш.
Все эти продукты я купила в магазине. А называют эти продукты так – «хлебобулочные продукты». Если вас спросят малыши, что такое хлебобулочные продукты, что вы им ответите? (Ответы детей).
Как называется магазин в котором продаются хлеб, булки, батоны? (Ответы детей). Хлебный магазин.
Вот перед вами хлеб. «Плох обед коли хлеба нет». Человек легко может обойтись без конфет и колбасы, а вот без хлеба плохо. Во все времена люди ценили и уважали хлеб. Хлебушек — ласково называют его.
Сегодня мы узнаем какое путешествие совершил хлебушек, пржде чем попал к нам на стол.
Вот растут пшеничные колоски. Посмотрите внимательно, все ли колоски одинаковые? Колоски разные. Возьмите в руки карандаш зеленого цвета и закрасьте самый маленький колосок. Этот колосок еще даже не созрел. Колосок побольше закрасьте карандашом желтого цвета. А самый большой колосок раскрасьте карандашом оранжевого цвета. Этот колос вызрел и готов подарить свои зерна.
Раз, два, три, четыре, пять – начинаем мы играть.
Мы закроем быстро глазки
И чтобы время не терять,
Будем мы теперь моргать.
И откроем их опять.
А теперь вращаем шеей.
Ищем цифры, как сумеем:
1
Это – цифра единица.
Первой быть она стремится!
Всех прямее и ровней,
Остальные все – за ней!
2
А вот это – цифра два:
Есть и хвост, и голова
С длинной шеей лебединой,
Переходит шея в спину.
3
Нет, ты только посмотри,
Как красива цифра три!
Стоит лишь два полукруга
Нам поставить друг на друга.
4
А четыре, посмотри
Та идет за цифрой три.
Очень острый локоток-
Подружись и с ней дружок.
5
Посмотри на цифру 5.
Взяв пятёрочку за ручку,
Можно как ковшом черпать
Воду и песок-сыпучку.
Вот на этих картинках нарисован путь от колоска до хлебушка. Только картинки все перепутались. Нужно расставить их по порядку. Что было сначала, а что потом. (Колосья, зерно, мука, тесто, хлеб).
Вот и испекли на хлебозаводе наш хлебушек. А как попадет он в магазин? (Ответы детей). На машине.
Положите перед собой листы бумаги с нарисованным городом и возьмите в руки машину-хлебовоз. Вы будете водителями и поведете машину в нужном направлении.
Поставьте машину в левый верхний угол. Здесь находится хлебозавод и в машину погрузят свежий хлеб, булки и другие вкусные продукты.
Проведите машину в центр, в самую середину.
Теперь машина поехала вправо.
Теперь вниз по улице.
Машина остановилась перед высоким домом.
Дальше машина поехала влево.
Остановилась за низким домом.
Машина поехала вверх по улице.
Машина вернулась на хлебозавод.
Раз — подняться, потянуться.
Два — согнуться, разогнуться.
Три — в ладоши три хлопка,
Головою три кивка.
На четыре — руки шире.
Пять — руками помахать.
Шесть — за парту тихо сесть.
Дети выполняют движения по тексту.
Привезли в хлебный магазин хлебобулочные продукты, нужно разложить их по полкам. Сколько полок на витрине? Две. Можно ли сказать, что полки одинаковые? Нет. Почему? Верхняя полка короткая, а нижняя длинная.
Выложите батоны на верхнюю полку. Сосчитайте, сколько батонов поместилось на верхней полке? Четыре батона.
Выложите батоны на нижнюю полку. Сосчитайте, сколько батонов поместилось на нижней полке? Пять батонов.
На какой полке больше батонов, на верхней, или на нижней? На нижней полке больше батонов.
А как сделать, чтобы на верхней и на нижней полке стало батонов поровну?
Доложить еще один батон на верхнюю полку мы не сможем — там нет места.
А вот убрать один батон с нижней полки можно. Вот теперь на нижней и на верхней полке одинаковое количество батонов.
Купили мы разные продукты в хлебном магазине. Теперь нужно разложить их на праздничном столе. У вас на есть скатерть с расставленными на ней блюдами. Рассмотрите внимательно хлебобулочные продукты и блюда для них.
Нужно подобрать к каждому продукту блюдо подходящей формы.
На какую геометрическую фигуру похож бублик? На круг. На блюдо какой формы нужно положить круглый бублик? На круглое блюдо.
На какую геометрическую фигуру похож хлеб? На прямоугольник. На блюдо какой формы нужно положить прямоугольный хлеб? На прямоугольное блюдо.
На какую геометрическую фигуру похож батон? На овал. На блюдо какой формы нужно положить овальный батон? На овальное блюдо.
На какую геометрическую фигуру похож пирожок? На треугольник. На блюдо какой формы нужно положить треугольный пирожок? На треугольное блюдо.
На какую геометрическую фигуру похож лаваш? На квадрат. На блюдо какой формы нужно положить квадратный лаваш? На квадратное блюдо.
Вы уже разложили все хлебобулочные продукты на блюда. Теперь нужно аккуратно наклеить их.
Скачать конспект итогового занятия по математике во 2-ой младшей группе «Путешествие хлебушка»
В осенние дни, гуляя по парку, не трудно получить массу позитива и набраться вдохновения. Самое время помочь ребёнку с развитием воображения и творческих навыков. Аппликации детей на тему осень родители готовы сохранять на память и показывать бабушкам как своеобразное достижение. Также эту тему любят использовать в школах и садах.
Существует множество идей аппликаций и поделок на тему осень, ведь и материал всем попадется разнообразный и фантазия у всех играет по — своему. Если же фантазия и вдохновение подводит, то вам на помощь придут шаблоны для осенней аппликации. Но очень часто происходит так, что собирая листики и другой природный материал, вы уже на ходу можете придумать идею для будущей работы.
Чтобы начать работу над поделкой из листьев, их предварительно необходимо засушить. Сделать это можно между листьями книг, или с помощью утюга. Храните листья между страницами книг или газетными листиками.
У детей появляется интерес к аппликациям и поделкам еще на этапе сбора материала. Малышам нравится собирать листья на дорожках во время прогулки, искать шишки и каштаны. Поэтому не трудно будет уговорить ребенка все это применить для создания красивой аппликации.
С самыми маленькими детками всегда сложнее заниматься и к ним нужно искать подход. Их нельзя заставить долго сидеть над одной работой. Поэтому и поделка должна быть как можно проще. Как сделать интересную поделку на осеннюю тему всего за несколько минут, чтобы вдохновить малыша на продолжение.
Кажется, что проще этой аппликации ничего нельзя отыскать.
Возьмите один красивый желтый листик. Поверните его широкой частью вниз. Приклеиваем на картон. Можно дорисовать ручки и ножки, а в руку вставить нарисованный зонтик.
Забавно будет смотреться такой листик с глазами. Их можно сделать из пластилина или картона, а может, вы найдете маленькие пуговки и приклеите их. Не забудьте сделать его веселым, нарисовав улыбку.
1. Коричневая бумага нам необходима для создания ствола дерева.
2. Обведите детские ладони на цветной бумаге, сделав несколько разноцветных заготовок.
3. Приклеиваем ствол дерева и листики на картон
Варианты накладной аппликации на тему осень из ладошек:
Еще один вариант аппликации для самых маленьких – это дерево
Сделать его просто: соберите тонкие ветки примерно одного размера и приклейте пучком на картон. Выше выкладываем листья, как крону. Получится осеннее дерево из листьев.
Можно сделать обрывную аппликацию из цветной бумаги.
Используя крупу можно сделать красивое осеннее дерево.
Покрасьте пшено разными красками. Нарисуйте ствол и ветки. С помощью ПВА приклейте крупу, создавай крону дерева.
Дети такого возраста любят зверей, ведь они как раз узнают мир и знакомятся с новыми особями животного мира.
Аппликации из природного материала в детском саду не отличаются большой сложностью. Для них можно использовать не только листья, но семена, желуди, веточки. Также применяют цветную бумагу, картон.
Красивые разноцветные листья, которые падают на землю с деревьев, можно преобразовать в осенний цветок.Создать такой цветок можно с помощью клея и листа картона.
Если одного цветка мало, то можно сделать вазу с цветами из осенних листьев.
Красивые зонтики получатся из кусочков цветной бумаги. Такой вид аппликации называется обрывной.
Аппликации из природного материала в детском саду занимают большой пласт программы развития детей. Осенние дары природы открывают множество границ для занятий с детьми. Поэтому осенние ярмарки – это место, где можно показать свои таланты.
Можно предложить детям придумать настоящую композицию из листьев.
Если совместить рисование и аппликацию, то можно сделать такого симпатичного ежика из семечек.
Используя лепестки цветов и веточки травы, можно делать красивые аппликации
Листья это самый доступный материал для того чтобы воплотить свой талант в создании ярких и красочных картин и аппликаций на тему осень. Подобрав листики правильной формы, у вас получаться разнообразные зверята и насекомые.
Очень удобно делать аппликации с детьми по готовым шаблонам. Для этого достаточно распечатать заготовку и вырезать.
Еще один вариант шаблона лисы из цветной бумаги из геометрических фигур.
Лисята могут получаться совершенно разные, но дополнив их рисунком, получатся интересные работы:
Необычная объемная аппликация из цветной бумаги
Смена природы осенью заметна всем и даже дети видят разницу, когда деревья становятся желтыми.
Создаем ствол дерева и ветки из коричневой цветной бумаги.
Приклейте дерево на фоновый лист картона, сделав предварительно крону дерева
На ветки дерева приклейте листики разного цвета.
Под деревом осенью можно всегда найти грибочки, поэтому научиться делать аппликации грибов тоже полезно.
Шаблоны грибов для вырезания для аппликаций
Если классические аппликации уже приелись и хочется какого-то разнообразия, то вы можете совместить рисование и поклейку природного материала. Такие работы вполне подходят в качестве аппликаций из природного материала для начальной школы.
Дети уже могут сделать подарок маме, нарисовав ее портрет и дополнив картинку листиками и другим природным материалом.
С помощью занятий с природным материалом можно также укреплять в детях понимание о смене погодных условий, объяснять им, какие есть сезоны и что происходит с их сменой.
Аппликация поздняя осень поможет раскрыть ребенку новый этап природы, который предшествует зимней погоде. Ведь поздней осень мы наблюдаем похолодание, листиков становится все меньше и последние листья ветер уносит с веток деревьев.
Аппликация на эту тему раскроет ребенку понятие, как лето меняется на осень, что происходит в этот период в природе. Ведь на деревьях еще много листьев, есть зеленые, но также появляются красные, оранжевые и бордовые.
Возьмите ненужные части пазлов, покрасьте их разными красками, какого цвета хотите листья на дереве. Ствол дерева можно нарисовать, а можно приклеить из бумаги.
Осень сопровождается дождями и атрибут, который можно найти в любой квартире – это зонт. Изобразить зонт и создать объемную аппликацию на осеннюю тему довольно просто.
Возьмем белый лист бумаги. Начиная от угла, рисуйте любой узор. Вырезать угол необходимо полукругом. Вырезанную часть листа складываем гармошкой.
Приклеим эту деталь на лист бумаги
Можно дорисовать капли дождя на листе бумаги.
Также можно использовать готовый шаблон, чтобы сделать зонтик.
Вырезаем шаблон, предварительно напечатав его, и делаем на нем узоры.
Также как и в предыдущем варианте, складываем заготовку зонтика гармошкой
Такие забавные зонтики могут получиться
Нарисуйте или распечатайте образ девочки и приклейте к ее руке зонт.
Не обязательно использовать только целые листики для аппликаций.Есть отдельно направление в творчестве – обрывная аппликация. Использовать можно не только листья, а и цветную бумагу. Принцип ее заключается в том, что силуэт фигуры создается из рваного материала.
Засушенные листья необходимо покрошить.
На картоне нарисуйте ствол и ветки дерева.
Когда краска высохнет, нанесите клей на ствол и ветки, где должны быть листья.
Посыпьте на клей кусочки листьев.
Немного придавите листики, чтоб зафиксировать.
Стряхните излишки листиков с аппликации.
Такое же дерево можно сделать с помощью цветной бумаги.
С такой аппликацией справиться не так то просто. Тут главное правильно подобрать листья
Эта поделка вполне подойдет для подарка учителя или маме от школьника. Ведь такой букет из листьев простоит намного дольше, чем свежий букет из настоящих цветов.
Предварительно высушите листья с разных деревьев. Подготовьте клей, ножницы и лист картона.
Сформируйте вазу из листьев, приклеив их на картон. А далее помогите ребенка создать красивый букет из листьев. Чтобы он получился ярким и аккуратным, используйте для поделки светлые листики, без дырок и пятен.
Вазу для осеннего букета из листьевможно сделать из цветной бумаги, а можно создать букет не только из листьев и обойтись без вазы.
В технике аппликации можно создавать красивые и оригинальные картины из разнообразного природного материала.
Соберите различные листья, веточки и цветочки, засушите их как гербарий и приступайте к созданию настоящих панно и картин.
Для такой картину прекрасно подойдут: мох, солома, колоски, семена, мелкие цветы
Каждому ребенку будет интересно сделать из бумаги разнообразные фрукты и овощи, которые они с раннего возраста употребляют в пищу. Их можно делать как аппликации на бумаге или объемными.
Нам потребуется лист красной двусторонней бумаги. Складываем его пополам и разрезаем. Половинки также складываем пополам и нарисуем силуэт половины яблока карандашом.
Приклеивает на лист бумаги половинки яблока, и создаем сердцевину, черенок и листик.
Делаем клубничку из бумаги
Из зеленой бумаги вырезаем хвостики.
Складываем два листика красной бумаги пополам и вырезаем сердечко
Одну часть приклеим к листу основанию, а вторую приклеим по линии сгиба.
Сверху приклеим зеленый хвост, вырезанный из шаблона, и нарисуем точки черным фломастером.
Из красной бумаги необходимо вырезать 4 кружочка (диаметр 5-6 см).
Согните кружки пополам и вырежьте зеленую полоску.
Возьмите зеленый лист 12*6 см и вырежьте листики, согнув бумагу пополам
На лист картона приклеивает полоску, сложенную пополам. Сверху приклеим листики, и по вишенке на каждую веточку
Вырезаем из распечатки шаблон основание.
Листик винограда можно покрасить карандашом или фломастером зелёного цвета
Из листа цветной бумаги вырезаем трубочки одинакового размера.
Приклеиваем свернутые в трубочку полоски на гроздь винограда
При занятиях с бумагой важен творческий процесс, но когда малыш мал, у него не всегда получаются предметы правильно формы. Важно не отбить у него охоту к творчеству, поэтому на помощь приходят шаблоны.
Простыми аппликациями с шаблонами можно озадачить ребенку уже с двух лет. Подготовив по шаблону детали, вы помогаете ребёнку знакомиться с формами разных предметов.
Его задача — приклеить на лист бумаги детали в правильном порядке и положении. В старших группах детского сада или в школе, дети справляются сами с вырезанием деталей по шаблону.
ПОЖАЛУЙСТА, ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: на 2021-2022 учебный год у нас есть только ограниченное количество мест в 6 классе. Мы заполнены и больше не принимаем заявления для учеников 7-12 классов.
После того, как вы отправите онлайн-запрос с помощью кнопки ниже, сотрудник приемной комиссии свяжется с вами, чтобы предоставить следующие шаги и запланировать экскурсию.Мы настоятельно рекомендуем вам взять с собой в тур любого заявителя, но обратите внимание, что туры ограничены для родителей и заявителей только . Мы рекомендуем вам прочитать некоторые из наших блогов, чтобы узнать больше о наших преподавателях, студентах и выпускниках.
2. После экскурсии подайте онлайн-заявку После экскурсии вы получите электронное письмо от вашего приемного комиссара с инструкциями по подаче онлайн-заявки, а также контрольный список других материалов для приема, необходимых из текущей школы учащегося, включая форму школьной успеваемости и рекомендацию учителя.Заявки и вся сопроводительная документация должны быть поданы вместе с заявочным взносом в размере 75 долларов США до 1 февраля. Семьи должны подать заявку, чтобы назначить День теней.
После того, как ваша заявка будет отправлена, вы получите электронное письмо от вашего приемного комиссара со ссылкой для бронирования Shadow Day для вашего студента. Во время визита вашего ученика он / она будет следить за принимающим учеником и посещать занятия, общаться и обедать со студентами, а также встречаться с преподавателями.Приемная комиссия проведет собеседование в какой-то момент в течение дня. Теневые дни назначены на пн. – чт. с октября по март.
4. Возьмите SSAT и снимок навыков персонажаЗарегистрируйтесь для прохождения вступительного испытания в среднюю школу (SSAT). Вот руководство по сдаче SSAT дома. Вам также необходимо будет пройти оценку навыков персонажа. Обязательно выберите Подготовительную школу Тампы (код 7612) в качестве школы, которая получает ваши отчетные оценки.Есть три новых варианта тестирования для сдачи SSAT. Регистрация на них начинается в августе.
Семьи в регионах, где ISEE (Независимый вступительный экзамен в школу) более распространен, чем SSAT, могут подать тест ISSE вместо SSAT.Зарегистрируйтесь на сайте www.iseetest.org.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кандидаты на младшие и старшие классы должны представить результаты PSAT или SAT вместо сдачи SSAT.
иностранных студентов сдают TOEFL или TOEFL Jr. Зарегистрируйтесь на сайте www.ets.org/toefl. Прокрутите вниз, чтобы просмотреть подробную информацию о требованиях к тестированию для иностранных студентов.
5. Оставайтесь на связи с нами Семьямрекомендуется войти в свою учетную запись, чтобы проверить статус файла зачисления своих учеников.Заполненные документы о зачислении проверяются приемными комиссиями на регулярной основе для всех классов, кроме 9 класса. Письма с уведомлением для абитуриентов 9 класса отправляются по почте 1 марта. Пока вы ждете, не стесняйтесь просматривать наше Руководство по учебе и студенческой жизни 20-21 или наши каталоги Описаний курсов на 2020-2021 годы. Послушайте, что нынешние семьи и выпускники говорят о своем опыте.
Разрыв между ростом населения и производством продуктов питания увеличивается из-за незначительного повышения урожайности, которое объясняется снижением плодородие почвы, вредители и болезни, а также изменение климата (Bailey-Serres et al., 2019). Дикие родственники пшеницы являются богатым источником нового малоиспользуемого аллельного разнообразия с большим потенциалом для улучшения культивируемой пшеницы за счет интрогрессии (Placido et al., 2013; Zhang et al., 2017; Hao et al., 2020). Сообщалось, что интрогрессия диких родственников в элитные сорта пшеницы повышает устойчивость к вредителям и болезням (Periyannan et al., 2013; Saintenic et al., 2013), повышает сопротивляемость к стрессу окружающей среды (Peleg et al., 2005; Placido et al., 2013) и увеличить урожай (Pasquariello et al., 2019). Однако на успех интрогрессивной селекции может повлиять отрицательный эпистаз между множественными аллелями дикой и культурной пшеницы (Nyine et al., 2020), особенно в областях хромосом с низким уровнем рекомбинации, где может происходить сцепление с отрицательно выбранными аллелями. снизить эффективность отбора выгодных вариантов (Hill and Robertson 1966).
Интрогрессия может проявлять плеотропные эффекты, влияя на несколько, часто не связанных между собой черт, не являющихся объектом прямого отбора.Например, интрогрессия от Ae. ventricosa в хромосому 7D пшеницы было связано с увеличением содержания белка в зерне и устойчивости к образованию глазных пятен за счет снижения урожайности (Pasquariello et al., 2019). У твердой пшеницы интрогрессия гена GNI-A1 из дикого эммера увеличила массу зерна за счет подавления плодовитости дистальных соцветий, что привело к отрицательной корреляции между количеством зерна и массой зерна (Golan et al., 2019). Интрогрессия Agropyron elongatum в плечо хромосомы 7DL пшеницы, которая, как известно, придает устойчивость к листовой ржавчине ( Lr19 ) (Wang and Zhang, 1996), также влияет на развитие корней, что приводит к улучшенной адаптации к водному стрессу (Placido et al., 2013) и засоленности (Dvorak et al., 1988), а также увеличение биомассы и урожайности (Reynold et al., 2001).
Урожайность – это комплексный признак, определяемый многими составляющими, такими как масса прироста в тысячи штук, количество зерен на колос, колосья на единицу площади, ширина, площадь и длина зерна среди других (Del Moral et al., 2003; Du et al. ., 2020; Zhang et al., 2018). Предыдущие исследования показали, что интрогрессия от диких и близких родственников улучшает урожай гексаплоидной пшеницы за счет изменения характеристик компонентов урожая за счет плеотропного взаимодействия между интрогрессированными и фоновыми аллелями гексаплоидной пшеницы (Jones et al., 2020). Сообщалось о значительных компромиссах между урожайностью, компонентами урожая и стабильностью урожая пшеницы. Исследование Pennacchi et al. (2019) показали, что доходность и стабильность доходности в большинстве случаев имеют отрицательную линейную зависимость. Другие факторы, такие как дата колошения, высота растений и биомасса, влияют на соотношение источник-поглотитель, что, в свою очередь, влияет на индекс урожая, что приводит к изменению урожайности и стабильности урожая (Reynold et al., 2001; Reynold et al., 2020). Поэтому баланс между компонентами урожайности необходим для повышения урожайности, максимизации потенциала урожайности и повышения стабильности урожайности пшеницы.
Генотипирование на основе последовательностей генерирует данные маркеров SNP с высокой плотностью, которые можно использовать для точного определения границ геномных сегментов, интрогрессированных от диких родственников (Kuzay et al., 2019; Nyine et al., 2020), предоставляя уникальную возможность для исследовать влияние интрогрессии на компромисс между характеристиками, влияющими на общий урожай. Несмотря на то, что полногеномное секвенирование стало дешевле, оно все еще выходит за рамки диапазона затрат, который позволил бы программам селекции пшеницы секвенировать большие популяции.Секвенирование линий-основателей с высокой глубиной охвата и использование этих генотипов в качестве контрольной панели для вменения отсутствующих и не генотипированных маркеров в потомстве, характеризующемся секвенированием SKIM с низким охватом, является рентабельной альтернативой. Существующие алгоритмы вменения (Browning and Browning 2013; Swarts et al., 2014; Davies et al., 2016) обеспечивают высокоточное прогнозирование отсутствующих генотипов для всего генома и, как было показано, повышают эффективность сканирования ассоциаций в масштабе всего генома, таким образом позволяя идентифицировать SNP или гаплотипы, связанные с интересующими признаками (Li et al., 2010; Nyine et al., 2019). Одним из преимуществ повышенной плотности маркеров, обеспечиваемой секвенированием всего генома, является возможность выполнять картирование ассоциации с использованием информации о гаплотипах, что улучшает обнаружение локусов количественных признаков, которые в противном случае были бы упущены при использовании отдельных SNP (Zhang et al., 2002 ; Lorenz et al., 2010).
Здесь мы исследовали влияние интрогрессии от Ae. tauschii в линии твердой красной озимой пшеницы по признакам урожайности и компонентов урожая, а также по гаплотипам из Ae.tauschii в разных локусах генома влияют на компоненты и общий урожай. С этой целью мы оценили фенотипическую изменчивость урожайности и составляющих признаков, биомассы и признаков цепкой чешуи в интрогрессивной популяции, полученной из Ae. tauschii и гексаплоидная озимая пшеница, фенотипированные в условиях орошения и богарного земледелия. Мы применили данные о разнообразии SNP, полученные с помощью полногеномного секвенирования при 10-кратном уровне охвата родительских линий, для определения генотипов в этой популяции (Nyine et al., 2020). Эта стратегия привела к 5,2 миллионам SNP, которые позволили нам идентифицировать интрогрессированный Ae. tauschii гаплотипов и оценить их влияние на вариабельность признаков с помощью полногеномного ассоциативного картирования и анализа эффекта блока гаплотипа. Эта популяция интрогрессии вместе с данными генотипа SNP с высокой плотностью обеспечивает ценный ресурс для эффективного развертывания Ae. tauschii в программах улучшения озимой пшеницы.
Исследуемая популяция была подробно описана Nyine et al. (2020). Короче говоря, популяция была создана путем скрещивания синтетических Ae. tauschii – октоплоидные линии пшеницы с рекуррентными гексаплоидными линиями озимой пшеницы. Осьтоплоидные линии были получены путем скрещивания пяти гексаплоидных линий озимой пшеницы с 21 разнообразным Ae. tauschii образцов. Полученные в результате гибридные растения F 1 , регенерированные из спасенных эмбрионов, обрабатывали колхицином для получения синтетических октоплоидов (Dale et al., 2017). Синтетические октоплоиды были однократно скрещены с соответствующими родительскими гексаплоидами пшеницы или с другой линией пшеницы. Растения BC 1 F 1 были самоопыляемыми и продвинулись путем опускания одного семени до поколения BC 1 F 3 . Семена от отдельных растений BC 1 F 3 растений собирали и выращивали в отдельные ряды на поле в Государственном университете Канзаса на исследовательской ферме Эшленд недалеко от Манхэттена, штат Канзас, в вегетационный период 2016-17 гг. В общей сложности из всей популяции была отобрана 351 линия на основе способности производить достаточное количество семян для проверки урожайности, общей пригодности, обмолота и фенологии, соответствующих адаптированным сортам пшеницы.
Популяция была фенотипирована в 2018 и 2019 годах в Колби (Канзас) и в 2020 году в Ашленде (Канзас). В обоих местах и годах для проведения испытаний использовался расширенный дизайн. Три гексаплоидные линии озимой пшеницы, хорошо адаптированные к условиям Канзаса (чеки), и родительские гексаплоидные пшеницы использовали в качестве контроля с минимум тремя биологическими повторениями на блок. В 2018 и 2019 годах были созданы два полных блока, один из которых был орошаем, а другой – богарным (без орошения), имитируя оптимальные условия выращивания на фермерских полях.В 2020 году в богарных условиях выращивался только один блок.
Популяция была фенотипирована по признакам урожая и компонентов урожая, признакам биомассы и цепкой чешуе. Программное обеспечение Agrobase (Mulitze 1990) использовалось для корректировки урожайности зерна (GY) (бушелей на акр) с учетом пространственной изменчивости. Система визуализации семян MARVIN (GTA Sensorik GmbH, Германия) использовалась для оценки морфометрических характеристик зерна, таких как количество зерен (GN) в образце, масса тысячи зерен (TGW), площадь зерна (GA), ширина зерна (GW) и размер зерна. длина (GL) из двух технических повторений в 2018 г. и одного измерения в 2019 и 2020 гг.В 2019 и 2020 годах были собраны данные о количестве шипов на квадратный фут (SPSF) из двух случайных точек на графике. Квадратная рамка размером 1 фут x 1 фут была размещена на двух рядах, по крайней мере, на расстоянии одного фута от краев участка, чтобы избежать эффекта границы. В 2019 году только одна строка в кадре была вырезана над уровнем земли для определения биомассы, тогда как в 2020 году были взяты пробы из обеих строк. Образцы биомассы собирали в бумажные пакеты и сушили не менее трех недель при 32 ° C (90 ° F) перед обработкой. Мы собрали данные о надземной сухой биомассе (BM), измеренной как общий вес сухого образца без мешка, количество шипов на образец (SPB), среднее количество шипов на шип (SNS) из 10 случайных шипов и вес зерна после обмолота (GSW).Во время обмолота мы оценивали образцы на наличие и отсутствие признака цепкой чешуи (Tg) в зависимости от обмолота. Индекс сбора урожая (HI) рассчитывали как процент GSW относительно BM.
В 2020 году данные о дате колошения (HD) были собраны с каждого участка, когда примерно 50% шипов вышли из листьев флага. Количество дней до колошения рассчитывалось как разница между датами колошения и посева. После того, как на всех делянках был заполнен колос, высота растений (PH) в сантиметрах была измерена в один и тот же день с двух случайных, но репрезентативных основных культиваторов на делянке для всего поля.PH измеряли как расстояние от поверхности земли до первого колоса шипа.
Геномная ДНК 21 Ae. tauschii и шесть гексаплоидных родителей, использованные для создания интрогрессивной популяции, экстрагировали из тканей листьев двухнедельных проростков, выращенных в теплице, с использованием DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Качество и концентрацию ДНК оценивали с помощью набора для анализа дцДНК PicoGreen (Life Technologies).
Геномные библиотеки для секвенирования Illumina были сконструированы из ~ 2 мкг геномной ДНК с использованием протокола Illumina без ПЦР в K-State Integrated Genomics Facility (IGF). Библиотеки были подвергнуты отбору по размеру с использованием системы Pippin Prep (Sage Scientific) для обогащения фрагментами 400-600 п.н. Объединенные библиотеки со штрих-кодами секвенировали с использованием прибора NovaSeq (запуск 2 × 150 п.о., проточная ячейка S4) в Медицинском центре Канзасского университета и NextSeq 500 (прогон 2 × 150 п.о.) в IGF. Среднее количество прочтений на одну линию пшеницы соответствовало примерно 10-кратному покрытию генома родительских линий.Необработанные чтения с показателем качества Phred менее 15, минимальной длиной менее 50 п.н. и последовательностями адаптеров были отфильтрованы с помощью Trimmomatic v0.38-Java-1.8. Оставшиеся отфильтрованные чтения с парного конца были сопоставлены с китайской Spring (CS) RefSeq v1.0 (IWGSC, 2018) с помощью программного обеспечения BWA-mem v0.7.17. Файлы sam, созданные BWA-mem, были преобразованы в файлы bam с помощью SAMtools v1.10. Picard Toolkit (http://broadinstitute.github.io/picard) использовался для объединения файлов BAM с разных дорожек и секвенсоров в один файл BAM для каждого образца.Чтения, которые выровнены по нескольким местам в геноме, были идентифицированы и удалены SAMtools v1.10. Picard Toolkit использовался для подготовки объединенных уникальных выровненных файлов BAM чтения для анализа GATK (McKenna et al., 2010). Подготовительные шаги включали сортировку, добавление групп чтения, отметку и удаление повторяющихся чтений. Выходные дедуплицированные файлы BAM были перестроены вокруг INDEL с использованием GATK v3.7 и повторно откалиброваны с использованием 90K SNP (Wang et al., 2014), сопоставленных с CS RefSeq v1.0 в качестве опорных координат.Файлы BAM были разделены на хромосомные части и проиндексированы, чтобы уменьшить объем памяти и время, необходимое для обработки файлов. GATK v3.7 использовался для создания файлов формата вызова вариантов генома (gvcf) для каждой части хромосомы. Файлы gvcf были разделены на хромосомные окна размером 100 МБ и сохранены как genomicsDB с помощью инструмента genomicsDBImport в GATK v4.0. Совместное генотипирование вариантов из каждой базы данных было выполнено с помощью GATK v4.0 HaplotypeCaller. Флаг <-allow-old-rms-mapping-quality-annotation-data> был установлен для включения обработки файлов gvcf, созданных GATK v3.7. Все файлы vcf, соответствующие геномам A, B и D, были объединены с помощью concat, утилиты на основе Perl в vcftools v0.1.13. Для преобразования координат частей китайского Spring RefSeq v1.0 в объединенном vcf в полные координаты использовался собственный скрипт Perl, после чего инструменты vcf-filter v0.1.13 использовались для удаления INDEL, мультиаллельных локусов, сайтов с отсутствующими данными и MAF. ниже 0,05. Отфильтрованные SNP были фазированы с использованием программного обеспечения Beagle v4.1 (Browning and Browning, 2013).
Генотипирование интрогрессивной популяции на основе последовательностей ранее было выполнено Nyine et al.(2020). SNP с частотой минорных аллелей (MAF) менее 0,01 были исключены из необработанного файла vcf с помощью инструментов vcf-filter v0.1.13. Программа consform-gt (https://faculty.washington.edu/browning/conform-gt.html) использовалась для проверки соответствия позиций SNP генома D между интрогрессивной популяцией и SNP от родительских линий, генотипированных полногеномным дробовиком. последовательность действий. Отсутствующие и не генотипированные SNP в геноме D интрогрессивной популяции были приписаны родительским линиям с использованием Beagle v.5.0. Пользовательский сценарий Perl использовался для фильтрации вмененных SNP с вероятностью генотипа ниже 0,7 и MAF менее 0,05. Отфильтрованные SNP использовались в последующих анализах, таких как картирование ассоциаций по всему геному и идентификация блоков интрогрессированных гаплотипов.
Генетическое расхождение между родительскими линиями влияет на вероятность точного обнаружения интрогрессированных сегментов от диких родственников. Мы использовали два интрогрессивных семейства, одно созданное скрещиванием гексаплоидной пшеницы с Ae.tauschii ssp. strangulata (KanMark x TA1642, aka FAM93) и еще один, созданный путем скрещивания гексаплоидной пшеницы с Ae. tauschii ssp. tauschii (Danby x TA2388, aka FAM97) для идентификации блоков интрогрессированных гаплотипов. FAM93 имел 21 линию интрогрессии, тогда как FAM97 имел 23 линии интрогрессии. Пакет R HaploBlocker (Pook et al., 2019) использовался для вывода блоков гаплотипов из 5,2 миллиона сайтов SNP. Рекомбинантные инбредные линии из каждого семейства анализировали вместе с 21 Ae.tauschii и шесть гексаплоидных родителей. Параметры HaploBlocker, используемые при вычислении блока, были node_min = 2 (по умолчанию 5), overlap_remove = TRUE, bp_map, equal_remove = TRUE. Параметр node_min использовался для управления количеством гаплотипов на узел на этапе объединения кластеров функции вычисления блоков HaploBlocker. Уменьшение node_min было необходимо для учета низкого количества вариантов гаплотипов в этих семьях. Чтобы поддерживать позицию SNP в библиотеке блоков гаплотипов, вектор SNP был предоставлен через параметр bp_map, и перед вычислением блока SNP в идеальном неравновесном сцеплении были удалены путем установки параметра equal_remove = TRUE.Перекрывающиеся гаплотипы были удалены установкой параметра overlap_remove = TRUE. Пользовательские сценарии R и Perl были использованы для расчета длины блока гаплотипа с использованием информации из координат начала и конца блока гаплотипа. Все мономорфные гаплотипы между двумя родительскими линиями были исключены из матрицы гаплотипов перед вычислением частоты интрогрессированных гаплотипов на хромосому.
Стабильность урожая – важный признак, который отражает продуктивность культуры в различных условиях роста.Однако ни одна статистика не является достаточно точной, чтобы ее предсказать, из-за высокой вариабельности генотипа и генотипа под влиянием эффектов взаимодействия с окружающей средой. В этом исследовании мы использовали 16 различных статистических данных, включая параметрические (например, компонент средней дисперсии ( θi ), компонент дисперсии GE ( θ (i) ), нековалентность Wricke ( W i ). 2 ), коэффициент регрессии ( * b i ), отклонение от регрессии ( S 2 di ), дисперсия устойчивости Шуклы ( s 2 i ), коэффициент дисперсии ( CVi ) и сумма рангов Канга ( Kang или KR )) и непараметрические (такие как Huhn’s и Nassar and Huhn’s ( S ( 1) , S (2) , S (3) , S (4) , S (5) и S (6) ) и Thennarasu’s ( NP (1) , NP (2) , NP (3) и NP (4 ) )) методы ранжирования линий интрогрессии по стабильности урожайности на основе их характеристик по годам, местоположению и обработкам.Описание и свойства статистики задокументированы по адресу: https://manzik.com/stabilitysoft/. Анализ был реализован в R с использованием скрипта от Pour-Aboughadareh et al. (2019), который доступен по адресу: https://github.com/pour-aboughadareh/stabilitysoft. Наиболее стабильные и / или высокоурожайные линии были определены путем их сортировки в соответствии с их рейтингом.
Наследуемость в широком смысле ( H 2 ) и наилучшие линейные несмещенные прогнозы (BLUP) для урожайности и характеристик компонентов были рассчитаны на основе данных 2018 и 2019 годов.Смешанная линейная модель с ограниченным максимальным правдоподобием, реализованная в пакете R lme4 , использовалась для генерации компонентов дисперсии (var), которые использовались для расчета наследуемости следующим образом. H 2 = var (Генотип) / [var (Генотип) + var (Генотип: Trt) / №. of Trt + var (Остаточный) / № of Trt)]. Где Trt относится к орошаемым и неорошаемым обработкам. BLUP были извлечены из линейной смешанной модели как случайные эффекты генотипов.
Множественное сравнение влияния обработки на характеристики урожайности и компонентов урожайности в интрогрессивной популяции по сравнению с контролями проводили с использованием средних значений наименьших квадратов (LS).Чтобы дополнительно оценить влияние интрогрессированных гаплотипов на признаки, линии были отсортированы в порядке убывания для каждой обработки и местоположения / год. Процент линий интрогрессии, которые показали лучшие результаты, чем лучшие родительские линии и проверки (PTPL), был рассчитан для каждого признака. Точно так же линии интрогрессии, которые дали больше зерен, чем оба родительских и контрольных, были идентифицированы на основе среднего пространственно скорректированного урожая. Процентное увеличение урожайности рассчитывалось следующим образом. Где Δӯ ij – процентное изменение среднего урожая, ӯ i – средний урожай для высокоурожайных интрогрессивных линий, а ӯ j – средний урожай для контролей (родительские и чеки).
Взаимосвязь между урожаем, компонентами урожая и характеристиками биомассы оценивалась путем расчета коэффициентов корреляции Пирсона. Мы сравнили тенденцию корреляций для разных обработок (орошение / неорошение) и лет, чтобы определить степень компромисса между признаками внутри интрогрессивной популяции и тем, как на них повлияла окружающая среда.
Анализ ассоциации в масштабе всего генома (GWAS) был использован для идентификации областей генома с SNP и гаплотипами, которые имеют значительную ассоциацию с признаками.Мы проверили ассоциацию 5,2 миллиона SNP из генома D с признаками, фенотипированными в разное лечение и в разные годы. Всего 15 967 окон блоков гаплотипов было идентифицировано из 5,2 миллиона SNP с использованием пакета R HaploBlocker v1.5.2 (Pook et al., 2019). Были использованы параметры по умолчанию для HaploBlocker, за исключением node_min, который был уменьшен до 2 (по умолчанию 5), поскольку большинство геномных интервалов в нашем наборе данных имели менее 5 вариантов гаплотипов. Перекрывающиеся гаплотипы были удалены с помощью параметра overlap_remove = TRUE, а координаты SNP были включены в библиотеку гаплотипов с помощью параметра bp_map.Блоки гаплотипов были разделены на окна путем установки параметра return_dataset = TRUE в функции block_windowdataset (). Варианты гаплотипов в пределах данного интервала хромосом были записаны как 0, 1, 2 или 3 в зависимости от общего числа вариантов гаплотипов, присутствующих в пределах интервала. В обоих случаях для обнаружения ассоциаций использовалась смешанная линейная модель, реализованная в пакете R GAPIT. Чтобы контролировать структуру популяции в анализе на основе SNP, для расчета основных компонентов использовались 100 000 случайно выбранных маркеров.В GWAS, основанном на блоках гаплотипов, все блоки гаплотипов использовались для вычисления основных компонентов. В обоих случаях для контроля структуры населения использовались только первые три основных компонента. Для выявления значимых ассоциаций использовались два пороговых значения, включая более строгую поправку Бонферрони и менее строгую частоту ложных открытий (FDR) Бенджамини и Хохберга (1995) при уровне значимости 5%. Для контроля эффекта лечения и года также проводился GWAS на основе BLUP, и о значимых ассоциациях сообщалось только при наличии ассоциации SNP-признака или гаплотипа-признака по крайней мере в двух независимых испытаниях или в анализе на основе BLUP.
Были проанализированы вариации гаплотипа в локусах со значительными SNP и их влияние на признаки в популяции интрогрессии. Пакет R HaploBlocker v1.5.2 (Pook et al., 2019) использовался для определения гаплотипов в геномных локусах со значительными ассоциациями SNP-признаков. Функция Heatmap.2, представленная в gplots пакета R, была использована для визуализации вариации гаплотипов гексаплоидной пшеницы и Ae. tauschii . SNP значимы при FDR ≤ 0.05 и их предполагаемые аллельные эффекты были выбраны из результатов сопоставления ассоциаций и использованы для проверки соответствия гаплотипического эффекта наблюдаемому фенотипу в популяции интрогрессии. Среднее значение и стандартное отклонение фенотипа вычисляли для каждой группы линий, несущих аналогичный гаплотип, и разницу между средними значениями сравнивали с использованием достоверно значимой разницы Тьюки и критерия Стьюдента t .
Наследуемость в широком смысле (H 2 ) GY составляла 0,7 в 2018 г. и 0,64 в 2019 г., в то время как для таких компонентов урожайности, как TGW, GA, GW и GL, H 2 значения составили 0,85, 0,89, 0,83 и 0,95 соответственно. Агрономические характеристики интрогрессивных линий относительно контрольных (родительские / контрольные) оценивали путем сравнения их характеристик урожайности и компонентов урожая при различных обработках. Влияние лечения на урожайность было значительным в 2018 г. (P <2.2e-16), но не в 2019 г. (P = 0,24) при уровне достоверности 95%. Последнее частично связано с более обильными осадками в 2019 году, которые уменьшили разницу в уровнях стресса для доступности воды между полевыми испытаниями на орошаемых и неорошаемых землях в Колби, штат Канзас. На основе средних значений наименьших квадратов значительные различия в урожайности между контрольными и интрогрессивными линиями наблюдались в 2019 и 2020 годах, но не в 2018 году (таблица 1). Данные об урожайности, собранные в ходе полевых испытаний на орошаемых и богарных (неорошаемых) полях, проведенных в период с 2018 по 2020 годы, показали, что до 23% линий с интрогрессиями дают больше зерна, чем контрольные (Рисунок S1).Однако в 2018 году 48% интрогрессивных линий дали больше зерна, чем чеки в неорошаемом испытании (CO18).
Таблица 1. Сравнение урожайности зерна между линиями интрогрессии (потомство) и контролем (чеки / гексаплоидные родители) на обработку в течение года с использованием средних значений наименьших квадратов (LS).Доля интрогрессивных линий, превосходящих контрольные и родительские линии по измеренным признакам, варьировалась в разные годы лечения и составляла минимум 0,8% для BM в испытании без орошения в 2019 г. (CO19) и максимум 73% для TGW в 2018 г. орошаемое испытание (COI18).Процентное увеличение урожайности для линий интрогрессии, которые превзошли как проверки, так и родительские, варьировало от 11% до 57%, в то время как количество линий, которые дали больше зерен, варьировалось от 6 до 94 (Таблица 2). В условиях стресса засухи в 2018 г. (CO18) средний урожай наиболее эффективных линий интрогрессии был в 1,6 и 1,4 раза выше, чем у чеков и родителей, соответственно (рис. 1). Эти результаты позволяют предположить, что некоторые интрогрессивные линии несут аллели, которые придают устойчивость к засухе, что обеспечивает высокую продуктивность в стрессовых условиях.Наивысший потенциал урожайности как линий интрогрессии, так и контрольных наблюдался в 2019 году: среднее значение для линий интрогрессии с максимальной урожайностью достигло 134 бушелей на акр (BPA), в то время как у родительских линий и чеков – 119 и 121 BPA, соответственно (Таблица 2). .
Таблица 2. Разница в средних процентах урожайности между наиболее эффективными линиями интрогрессии и контролями (родительскими и контрольными) для каждой обработки в каждый год и местоположение. Рисунок 1. Коробчатые диаграммы, сравнивающие средний урожай зерна между наиболее эффективными линиями интрогрессии (IL) и контролями (родители и проверки) в зависимости от лечения, года и местоположения.Где AS20 относится к испытаниям на богарных землях Ashland в 2020 году, CO18 – к испытаниям на богарных землях Колби в 2018 году, COI18 – к испытаниям на неорошаемых землях Колби в 2018 году, CO19 – к испытаниям на неорошаемых землях Колби в 2019 году, а COI19 – к испытаниям на богарных полях Колби в 2019.
Анализ стабильности урожая был проведен для выявления линий интрогрессии, которые являются одновременно высокоурожайными и стабильными в различных условиях окружающей среды. Ранжирование по средней урожайности показало, что 6% линий, несущих интрогрессию, дали больше зерен, чем большинство родительских линий, за исключением Ларри (Файл S1).Урожайность этих линий варьировала от 84,4 до 92,7 BPA. Средний ранг (AR) из 16 статистических данных о стабильности выявил 12 линий с интрогрессиями, показывающими высокую стабильность урожая. Пять из этих линий были стабильными и высокоурожайными по сумме рангов Канга по сравнению с контролем. Урожайность этих пяти линий интрогрессии (KS15SGDCB110-11, KS15SGDCB098-1, KS15SGDCB103-6, KS15SGDCB098-14 и KS15SGDCB111-1) варьировала от 82 до 93 BPA. Урожайность наиболее стабильной и высокоурожайной линии интрогрессии (92.7 BPA) была на 9,8% выше, чем средняя урожайность контролей (84,4 BPA). Эти результаты показывают, что новые аллели из Ae. tauschii обладают потенциалом для увеличения адаптивного потенциала твердой красной озимой пшеницы к различным условиям окружающей среды. Кроме того, статистика стабильности может помочь определить приоритеты линий интрогрессии для развертывания в различных агроэкологических зонах в зависимости от их ранжирования по стабильности и урожайности. Линии с умеренно высокой урожайностью, но с хорошей стабильностью урожая могут быть развернуты в неблагоприятных условиях, в то время как менее стабильные, но высокопроизводительные линии могут быть развернуты в менее стрессовых условиях для достижения высокой производительности.
Индекс урожая (HI), показатель способности источника-поглотитель, также был оценен на стабильность при испытаниях на орошаемых и богарных землях. Девяносто две интрогрессивные линии показали более высокий средний HI (47,4-52,8), чем лучшая родительская линия KS061406LN-26 (47,3). Средний рейтинг, основанный на 16 статистических данных о стабильности, помещает 11 из 92 строк в 20 самых стабильных строк (файл S2). Линия KS15SGDCB111-1, которая является высокоурожайной и стабильной, также входит в пятерку лидирующих линий со стабильным и высоким средним значением HI.
Коэффициенты корреляции Пирсона между средней урожайностью и стабильностью урожая на основе среднего ранга (AR) из 16 статистических показателей стабильности составили -0,44 (P <0,001). Однако корреляция между урожайностью и суммой рангов Канга (KR) составила -0,71 (P <0,001), что указывает на то, что наиболее стабильные линии интрогрессии не обязательно были самыми высокими урожайностями зерна, хотя были некоторые исключения. Точно так же корреляция между средним HI и AR составила -0.42 (P <2,2e-16), в то время как между HI и KR было -0,72 (P <2,2e-16).
Компромисс между доходностью и компонентами доходности зависел от обработки, года и местоположения, о чем свидетельствует изменение уровней корреляций (файл S3). Более высокие положительные корреляции наблюдались между морфометрическими признаками зерна, такими как TGW, GA, GW и GL, в диапазоне от 0,13 (между GW и GL) до 0,96 (между TGW и GA) (Рисунок 2). HI и GSW положительно коррелировали с GY, тогда как корреляция между GY и GN была положительной, но несущественной во всех испытаниях, за исключением испытания с орошением Colby в 2019 году (COI19) (файл S3).BM отрицательно коррелировал с HI, но показал положительную корреляцию с GSW (файл S3). В некоторых случаях увеличение SNS приводило к снижению TGW, GA, GW или GL, что согласуется с ранее наблюдаемым компромиссом между этими характеристиками (Kuzay et al., 2019). Напротив, HD положительно коррелировал с SNS и PH, что согласуется с предыдущими выводами (Shaw et al., 2013; Muqaddasi et al., 2019).
Рис. 2. Коэффициенты корреляцииПирсона между урожайностью и характеристиками компонентов урожайности в Colby в богарных испытаниях 2018 г. ( A ) и Ashland в богарных испытаниях 2020 г. ( B ).Где HD – дата заголовка, PH – высота растения, BM – наземная сухая биомасса, SPSF – колосья на квадратный фут, SPB – колосья на мешок, SNS – количество колосков на колос, GSW – вес образца зерна, HI – индекс урожая, GN – номер зерна, TGW – вес тысячи зерен, GA – площадь зерна, GW – ширина зерна, GL – длина зерна, GY – урожайность зерна.
Чтобы лучше понять вклад различных компонентов урожая в конечный урожай, мы сравнили фенотипы линий интрогрессии с максимальной урожайностью с фенотипами контрольных линий для всех обработок (файл S4). В испытании CO18 в условиях без полива интрогрессивные линии, которые превосходили контрольные по урожайности, имели самые высокие TGW, GA и GL, тогда как в условиях орошения (COI18) все признаки компонентов урожайности показали самые высокие уровни экспрессии в верхних урожаях. линии интрогрессии.Линии интрогрессии с наивысшим урожаем в исследовании CO19 имели самые высокие HI, GW, SNS и BM, в то время как TGW и GA были сопоставимы с таковыми из родительских линий. В исследовании COI19 признаки TGW, GA и GW внесли больший вклад в конечный урожай по сравнению с признаками GL, HI и BM. В испытании AS20 высокий уровень гетерогенности наблюдался среди высокопродуктивных линий по признакам TGW, GA, GW и GL. Однако эти линии показали более высокий BM, чем контрольные, что привело к снижению HI.
Ранее предполагалось, что интрогрессия от диких родственников может иметь негативное влияние на агрономические признаки из-за отрицательного эпистаза между аллелями дикой и культурной пшеницы (Nyine et al., 2020). Мы исследовали взаимосвязь между общим размером интрогрессированных геномных сегментов и фенотипом. Мы обнаружили положительную линейную зависимость между GA, GL, SNS и общим размером интрогрессированных сегментов (рис. 3, файл S5). Однако для TGW положительная линейная зависимость наблюдалась только в стрессовых условиях засухи, что указывает на то, что некоторые линии пшеницы с крупными интрогрессиями эффективны в использовании ограниченной влажности почвы и питательных веществ во время насыпки зерна. Отрицательная связь между GY, HI, GW, TGW в условиях орошения и размером интрогрессии.
Рисунок 3.Зависимость между количеством колосков на колосе ( A, и B ), длиной зерна ( C, и D ), урожайностью зерна ( E и F ) и долей интрогрессии под неорошаемые условия в Колби в 2019 г. ( CO19 ) и в Эшленде в 2020 г. ( AS20 ). Здесь r – коэффициент корреляции, а P – значимость корреляции между размером интрогрессии и наблюдаемым фенотипом признака.
Библиотеки полногеномного секвенирования без ПЦР, полученные из 27 родительских линий, варьировались от 200 до 700 п.н. со средним значением 450 п.н. (Рисунок S2). Приблизительно 14 миллиардов считываний парных концов (длиной 150 п.н.) было сгенерировано из библиотек, в среднем 0,54 миллиарда считываний на образец. В общей сложности 7,1 миллиарда операций чтения были однозначно согласованы с CS RefSeq v1.0. GATK v4.0 HaplotypeCaller идентифицировал около 99 миллионов вариантов, включая SNP и INDEL, из считываний, однозначно выровненных с геномом D CS RefSeq v1.0. После исключения INDEL, мультиаллельных локусов, сайтов с отсутствующими данными и MAF ниже 0,05 было сохранено 20 миллионов SNP. Их использовали для вменения отсутствующих и не генотипированных SNP в геноме D интрогрессивной популяции. Общее количество SNP генома D, оставшееся после фильтрации SNP с вероятностью генотипа ниже 0,7 и MAF <0,05, составило 5,2 миллиона.
Использование HaploBlocker v1.5.2, мы идентифицировали 4764 и 6429 неперекрывающихся блоков гаплотипов в Ae. tauschii ssp. strangulata (FAM93) и Ae. tauschii ssp. tauschii (FAM97) семейств соответственно. После фильтрации мономорфных гаплотипов между родительскими линиями 869 (18%) и 3020 (47%) сегрегационных гаплотипов были сохранены в FAM93 и FAM97, соответственно (таблица 3, файл S6). Низкая доля сегрегационных гаплотипов между гексаплоидной пшеницей и ssp. strangulata D геномов согласуется с выводом о том, что Ae.tauschii ssp. strangulata был донором генома D гексаплоидной пшеницы (Wang et al., 2013). Эти результаты также предполагают, что высокое сходство между геномом ssp. strangulata и геном D гексаплоидной пшеницы могут привести к недооценке доли интрогрессированных гаплотипов. Средняя длина блока гаплотипа по всему геному в FAM93 была выше (2 МБ), чем в FAM97 (1 МБ), (файл S6).
Таблица 3. Вариация интрогрессированных гаплотипов между Ae.tauschii ssp. strangulata (FAM93) и Ae. tauschii ssp. tauschii (FAM97) семейств.Наблюдалась значительная разница в длине интрогрессированного гаплотипа между линиями в FAM93 и FAM97 на основе t-критерия (P = 3.1e-16). Самый длинный гаплотип, интрогрессированный во всех линиях из FAM93, составлял 44 Мб на плече хромосомы 3DL, тогда как в FAM97 только четыре линии имели гаплотип> 32 Мб в плече хромосомы 7DL. Количество сегрегационных гаплотипов в FAM93 варьируется от 32 (3D) до 336 (2D), тогда как в FAM97 количество сегрегационных гаплотипов варьируется от 173 (3D) до 617 (5D) (Таблица 3).В FAM93 и FAM97 средняя частота каждого гаплотипа из Ae. tauschii в интрогрессивных линиях было 11 и 4 соответственно (файл S6).
Полногеномное исследование ассоциации было выполнено на Ae. tauschii , чтобы оценить влияние интрогрессии в геном D на вариацию признаков, связанных с биомассой, урожаем и компонентами урожая, а также цепкой чешуей.Анализ ассоциации маркера и признака был основан как на индивидуальных SNP, так и на блоках гаплотипов, идентифицированных HaploBlocker из 5,2 миллиона вмененных вариантов. Мы сообщаем только о тех ассоциациях, которые воспроизводятся по крайней мере в двух независимых полевых испытаниях и показывают значительную связь как с SNP, так и с гаплотипами при FDR 0,05 (таблица S1). Несколько геномных локусов со значительными ассоциациями, распределенных на хромосомах генома D, были обнаружены для GL, GW и SNS. Для других признаков, таких как GY, TGW, GN, GA, HI, BM, GSW и SPSF, не было обнаружено устойчивых ассоциаций, воспроизведенных в независимых исследованиях.
Мы определили несколько значимых ассоциаций SNP-признака и гаплотипа-признака из всех испытаний на хромосомных плечах 2DS и 7DS для GL (рисунок 4). Наиболее значимые SNP были расположены в окнах гаплотипических блоков 22 262 355 – 22 289 017 пар оснований, 30 582 113 – 30 595 115 пар оснований и 80 864 297 – 81 398 316 пар оснований на плече хромосомы 2DS и 11 024 311 – 11 374 767 пар оснований на плече хромосомы 7DS (Таблица S1). Анализ ассоциации, основанный на BLUP, подтвердил результаты отдельных испытаний GL на этих двух хромосомах.Другие значимые ассоциации, обнаруженные по крайней мере в двух испытаниях, были идентифицированы на хромосомных плечах 3DS и 5DS (файл S7).
Рисунок 4.Манхэттенские графики, показывающие локусы генома D с SNP и гаплотипами, которые в значительной степени связаны с количеством колосков на колос в Ашленде в 2020 году ( AS20, ) в условиях богарного земледелия ( A и B ) и длиной зерна Colby в 2018 г. ( COI18 ) в условиях орошения ( C и D ) в Ae.tauschii интрогрессивная популяция. Горизонтальная сплошная черная линия показывает порог уровня значимости 0,05 для коррекции Бонферрони, черные стрелки указывают SNP и гаплотипы выше порога.
Мы идентифицировали гаплотипы со значительными SNP, ассоциированными с GW, на 1DL, 2DS, 6DL и 7DS по крайней мере в двух независимых испытаниях, которые были подтверждены анализом оснований BLUP (файл S7). Окна блоков гаплотипов 65 964 778 – 66 124 103 п.н. и 66 265 325 – 66 266 089 п.н. показали наиболее значимую связь на 2DS.
При уровне достоверности 95% наиболее значимые ассоциации SNP-признаков были идентифицированы на хромосомных плечах 2DS и 6DL для SNS в трех независимых исследованиях (COI19, CO19 и AS20) (рис. 4, файл S7). Наиболее важные ассоциации расположены в 16,5 Мбайт и 463,8 Мбайт на 2DS и 6DL соответственно. Анализ гаплотипа-признака подтвердил ассоциацию на 2DS для SNS в локусе 16,5 Mb, расположенном в окне блока гаплотипа 16 497 666 – 16 548 006 п.н. При FDR <0,05 не было окна блока гаплотипа в локусе 6DL, которое перекрывалось значимой ассоциацией SNP-признака.
Предыдущие исследования показали, что социальные сети связаны с HD (Shaw et al., 2013; Muqaddasi et al., 2019). В текущем исследовании мы обнаружили значительные ассоциации с SNS на хромосомных плечах 2DS и 6DL. У нас были данные за один год для HD и PH, собранные в Ashland в 2020 году, что предоставило нам хорошую возможность проверить эту ссылку в Ae. tauschii интрогрессивная популяция. Полногеномное ассоциативное картирование обнаружило значительную связь с HD на плечах хромосом 2DS и 4DL, в то время как все хромосомы D-генома показали значительную связь с PH, но самые сильные сигналы наблюдались на 1DS, 3DS и 6DL.Окно блока гаплотипа 16 548 753 – 16 639 561 п.н. на 2DS с наиболее значимыми SNP для HD перекрывает локус, показывающий значительную связь с SNS, который находится в непосредственной близости от другого блока гаплотипа, перекрывающегося с наиболее значимыми SNP для SNS (16 497 666 – 16 548 006 п.н.). Эти результаты предполагают, что экспрессия этих двух признаков может совместно регулироваться.
Для HD окна гаплотипических блоков на плече хромосомы 4DL 442,735,095 – 442,751,954 п.н. и 459,271,685 – 459,290,731 п.н. имели наиболее значимые ассоциации SNP-признаков.Известно, что на три признака (SNS, HD и PH) влияют гены Rht8 и Ppd-D1 на 2DS, в дополнение к Rht1 на 4D, который контролирует высоту растений и время цветения (Borojevic и Borojevic 2005; Chen et al., 2018). Из-за отсутствия SNP, расположенных рядом с локусом гена Ppd-D1 на ∼34Mb (интервал 33 961 438 – 33 951 651 п.н. в CS RefSeq v1.0), мы не смогли напрямую подтвердить его связь с этими признаками. Однако значимые ассоциации для SNS были обнаружены на ∼3 Мб рядом с локусом Ppd-D1 в испытаниях CO19 и AS20 на блоках гаплотипов 2D: 30,192,335 – 30,264,745 п.н. и 2D: 28,829,778-28,937,705 п.н., соответственно.В родительских линиях с высокой плотностью SNP (~ 20 миллионов) локус Ppd-D1 имел SNP, что позволило нам точно картировать гаплотипы из Ae. tauschii и гексаплоидные линии пшеницы. Результаты показывают, что все гексаплоидные родители несут идентичный гаплотип, который отличается от гаплотипа Ae. tauschii (рис. 5А). Области, дистальные и проксимальные по отношению к локусу Ppd-D1 , обнаруживают гаплотипический полиморфизм в гексаплоидных линиях, в то время как геномная область около 10 Mb, окружающая локус Ppd-D1 , не обнаруживает вариаций гаплотипов в Ae.tauschii строк. Когда значимые SNP из 2DS использовались для расчета неравновесия по сцеплению в пределах 35 Mb от начала хромосомы, среднее значение R 2 составляло 0,88, а LD снижалась до нуля на 15 Mb, что указывает на связь между геномными локусами со значительными SNP с SNS и ген Ppd-D1 (рис. 5В).
Рисунок 5.Эффект гаплотипов, интрогрессированных из Ae. tauschii в хромосомные плечи 2DS и 4DL гексаплоидной пшеницы по количеству колосков на колос (SNS) и дате заголовка (HD) линий интрогрессии и возможной связи с геном Ppd-D1 , расположенным на 2DS.( A) График, показывающий варианты гаплотипов в локусе гена Ppd-D1 (черный прямоугольник) у озимой пшеницы и Ae . tauschii строк. ( B) График распада неравновесного сцепления на основе значимых SNP, связанных с SNS при FDR 0,05 на плече хромосомы 2DS (1-35 Mb). (C) Коробчатая диаграмма, показывающая влияние интрогрессии из Ae. tauschii в плечах хромосом 2DS и 4DL в SNS. (D) Коробчатая диаграмма, показывающая влияние интрогрессии из Ae.tauschii в хромосомных плечах 2DS и 4DL на HD. ( E) Диаграмма Венна, показывающая количество линий интрогрессии в процентиле 90 -го для SNS и HD. Линии на пересечении имеют возрастающие аллели как по локусам 2DS, так и по 4DL, связанным с SNS и HD.
Значимые ассоциации гаплотип-признак были идентифицированы на хромосомных плечах 2DS и 4DL, которые влияют на SNS и HD.Хромосома 2DS имела несколько интрогрессированных гаплотипов, которые в значительной степени связаны с вариациями SNS и HD, причем наиболее значимые гаплотипы располагались на 16 497 666–16 548 006 п.н. и 16 548 753–16 639 561 п.н. для SNS и HD, соответственно. Варианты гаплотипов с увеличивающимся эффектом по этим локусам были из Ae. tauschii , а те, которые обладают восстанавливающим эффектом, были от линий гексаплоидной пшеницы (рис. 5C, 5D). Проверка результатов GWAS на аллельный эффект в локусе 2DS, ассоциированном с SNS и HD, подтверждает вышеуказанное наблюдение (файл S8).Мы наблюдали положительный коэффициент корреляции Пирсона между SNS и HD, и линии, имеющие гаплотипы от любого из родителей, показали значительные различия в фенотипе на основе t-теста ( r = 0,23, P = 3,31e-07) с уровнем достоверности 95%. Гаплотипы на 4DL имели меньшее влияние на SNS по сравнению с HD. Среди 35 и 66 линий интрогрессии, имеющих значения признаков SNS и HD выше 90 -го процентиля распределения признаков, соответственно, 13 линий имели возрастающие аллели от Ae.tauschii как по локусам 2DS, так и по 4DL, связанным с признаками SNS и HD (рис. 5E).
Хотя у нас не было значимого сигнала GWAS в локусе Ppd-D1 из-за отсутствия SNP в этой области в вмененном наборе данных, мы идентифицировали линии с гаплотипами, которые перекрываются со значительной ассоциацией гаплотип-признак в двух испытаниях. на 28 Мб и 30 Мб, которые находятся в пределах ~ 3 Мб от локуса Ppd-D1 , предполагая, что эти блоки гаплотипов, вероятно, перекрываются с Ppd-D1 (Таблица S1).Эти результаты согласуются с более ранними исследованиями, которые показали, что ген Ppd-D1 , расположенный на ~ 34 Mb (интервал 33 961 438 – 33 951 651 пар оснований в CS RefSeq v.1.0), который играет роль в регуляции времени цветения у пшеницы, также имеет сильную влияние на вариацию в SNS (Beales et al., 2007, Guo et al., 2010).
Мы также оценили влияние различных гаплотипов, связанных с HD, на другие признаки. Гаплотип Hap_AeT из хромосомы 2D, расположенный на 16 548 753 – 16 639 561 п.н., связан со значительным увеличением количества дней до колошения и SNS без значительного влияния на BM, HI и GSW (Таблица 4).
Таблица 4. Варианты гаплотипов хромосомы 2D, связанные с числом колосков и датой заголовка, и как они влияют на другие признаки в популяции интрогрессии.Мы сравнили эффекты двух гаплотипов, связанных с GW, на 2DS (2D: 65,964,778 – 66,124,103 п.н. и 2D: 66,265,325 – 66,266,089 п.н.), где Hap_HW от гексаплоидных родителей и Hap_AeT_st от Ae. tauschii ssp. strangulata увеличивают GW и Hap_AeT_ta по сравнению с Ae. tauschii ssp. tauschii родителей снижает ГВ (табл. 5).В данных исследования Colby 2018 без орошения гаплотип в локусе 2D: 65 964 778 – 66 124 103 п.н., который был связан с увеличением GW и GL, также был связан с увеличением площади зерен и уменьшением количества зерен. В то время как оба гаплотипа Hap_AeT_st и Hap_AeT_ta в 2D: 65 964 778 – 66 124 103 п.н. были связаны с увеличением длины зерна, только Hap_AeT_ta был связан со значительным увеличением числа зерен (Таблица 5). Гаплотип Hap_AeT_ta в 2D: 66,265,325 – 66,266,089 п.н. блок гаплотипа имел аналогичные эффекты на GN, хотя наблюдаемое различие не было значимым.
Таблица 5. Варианты гаплотипов хромосомы 2D, связанные с шириной зерна в богарных испытаниях Colby 2018, и их влияние на другие признаки в популяции интрогрессии.Аналогично, блок гаплотипа 6D: 463 775 852 – 463 809 722 п.н., связанный с PH и SNS, имеет три варианта (файл S7). Вариант гаплотипа Hap1_HW & AeT связан с увеличением SNS, PH, BM и GY. Он не показал никакой связи с HD и характеристиками зерна, за исключением числа зерен, где наблюдался промежуточный эффект. Этот вариант гаплотипа присутствует у двух Ae.tauschii (TA2389 и TA2398) и гексаплоидных родителей, за исключением KanMark и KS061862M-17. Вариант гаплотипа Hap0_HW & AeT, который встречается в KanMark и KS061862M-17, и два ssp. strangulata Образцы (TA1642 и TA2378) оказывают промежуточное действие на GY, уменьшая его на 2 бушеля по сравнению с Hap1_HW и AeT. Третий вариант гаплотипа (Hap_AeT) присутствует только у Ae. tauschii строк.
Гаплотип Hap_AeT, внесенный Ae. tauschii в блоке гаплотипа 7D: 14,185.651 – 14 596 748 п.н., было связано со значительным увеличением SNS по сравнению с гаплотипами, присутствующими в озимой пшенице (Таблица S2). Это увеличение было связано со значительным снижением GL и не оказало значительного влияния на GY. На 7D: 14 722 457 – 14 817 138 п.н. гаплотип Hap_AeT внесен Ae. tauschii также был связан со значительным увеличением SNS по сравнению с Hap1_HW и AeT, обнаруженным как у гексаплоидной пшеницы, так и у Ae. tauschii родителей. Однако увеличение SNS для этого гаплотипа было связано со снижением как GL, так и GY.В этом блоке гаплотипа (7D: 14 722 457 – 14 817 138 п.н.) наиболее значимое увеличение GY наблюдалось для линий, несущих гаплотип Hap0_HW и AeT, что было связано с умеренным увеличением как SNS, так и GL (Таблица S2).
Здесь мы выполнили основанный на последовательностях анализ гаплотипов в популяции интрогрессии дикого родственника, полученной путем скрещивания разнообразной панели Ae. tausc hii образцы с сортами озимой пшеницы. Наши результаты демонстрируют, что сочетание полногеномного секвенирования линий-основателей дикой и культивируемой пшеницы с упрощенным секвенированием полученной интрогрессивной популяции обеспечивает эффективную основу для вменения SNP.Поскольку большинство селекционных популяций основаны на ограниченном количестве основателей, часто включающем 10-30 линий, их полногеномное секвенирование возможно для сельскохозяйственных культур даже с такими большими геномами, как пшеница, и обеспечивает всестороннее описание аллельного разнообразия, присутствующего в селекционной популяции. Последнее делает создателей секвенирования идеальной контрольной панелью для определения генотипов в племенной популяции, генотипированной с использованием секвенирования с низким охватом или снижением сложности. Это было недавно продемонстрировано путем вменения генотипов в популяцию MAGIC пшеницы, генотипированных с помощью секвенирования с низким охватом (Scott et al., 2021). Состав нашей интрогрессивной популяции, включающей несколько семей с двумя родителями (Nyine et al., 2020), также сдвигает частоту популяционных аллелей в сторону более распространенных вариантов, которые могут быть рассчитаны с более высокой точностью, чем редкие варианты (Huang et al., 2015 ). Кроме того, высокие уровни LD в интрогрессивной популяции должны увеличивать длину блоков гаплотипов и облегчать обнаружение совпадающих гаплотипов в контрольной панели основателей с использованием даже разреженных данных генотипирования, полученных с помощью секвенирования с низким охватом или уменьшения сложности.В соответствии с этими предположениями, алгоритм вменения, реализованный в Бигле (Browning and Browning, 2013), позволил нам вменять почти 5,2 миллиона SNP в популяции интрогрессии с высокой вероятностью вызова генотипа выше 0,7 с использованием SNP, сгенерированных упрощенным секвенированием этой популяции и почти 20 миллионов вариантов выявлено у 27 учредителей. Эти данные с высокой плотностью маркеров SNP позволили детально охарактеризовать интрогрессированные гаплотипы (Pook et al., 2019) и оценить их влияние на характеристики продуктивности.
Наши результаты демонстрируют, что дикие относительные интрогрессии в геном D пшеницы, наименее разнообразные среди трех субгеномов (Chao et al., 2010; Singh et al., 2019; Jordan et al., 2015), связаны с повышенный уровень вариации урожайности и характеристик компонентов урожая. Анализ данных за несколько лет и мест в условиях орошения и без орошения выявил множество превосходных линий интрогрессии, которые дают больше зерен или демонстрируют более высокую стабильность урожая, чем контрольные сорта.Повышение урожайности в наиболее эффективных линиях интрогрессии было обусловлено комбинацией характеристик компонентов урожая, и во многих случаях это было связано с увеличением размера зерна, веса зерна и биомассы или улучшенным индексом урожая. Эти результаты предполагают, что интрогрессия диких родственников может положительно повлиять на баланс источник-поглотитель, который, как предполагалось, является одним из важных факторов, влияющих на потенциал урожайности (Reynolds et al., 2017). Многие из этих высокоурожайных линий (~ 23%) также были среди верхних линий, показывающих самые высокие уровни стабильности урожая, что указывает на интрогрессию от Ae.tauschii , вероятно, улучшает адаптационный потенциал твердой красной озимой пшеницы в различных условиях окружающей среды. В соответствии с этим выводом, наибольшее влияние интрогрессии на урожайность было обнаружено в испытании без орошения, что указывает на то, что аллели от Ae. tauschii , вероятно, улучшит адаптацию гексаплоидной пшеницы к водоограничивающим условиям. Модель Ae. Образцы tasuchii , использованные для создания популяции интрогрессии, представляют как линии L1, так и L2 (Wang et al., 2013) и происходят из широкого диапазона географических мест с переменными климатическими условиями, вероятно, улавливая адаптивные гаплотипы из регионов, подверженных стрессу засухи.
Дата колошения является одним из ключевых агрономических признаков, связанных с адаптацией пшеницы к разным географическим условиям и повышением урожайности (Jung and Müller 2009). В нашей популяции наблюдалась положительная корреляция между датой колошения и количеством колосков на колосе, при этом в некоторых строках отмечалась двухнедельная задержка в дате колошения.Несколько блоков гаплотипов на плечах хромосом 2DS и 4DL были в значительной степени связаны с вариациями количества колосков и даты заголовка. Гаплотипы с усилением эффектов в обоих локусах произошли от Ae. tauschii , что указывает на их способность модулировать оба признака у мягкой пшеницы. Известно, что хромосома 2DS содержит гены Ppd-D1 и Rht8 , которые контролируют время цветения и высоту растения, соответственно, а также могут влиять на количество колосков (Shaw et al., 2013; Мукаддаси и др., 2019). Перекрывающиеся блоки гаплотипов, связанные с числом колосков и датой заголовка, были идентифицированы в 2DS, подтверждая, что эти два признака совместно сегрегируют в популяции. Ген Ppd-D1 находился на расстоянии ~ 3 мб от одного из гаплотипов, связанных с числом колосков на 2DS, что позволяет предположить, что аллель Ppd-D1 из Ae. tauschii , вероятно, влияет на эти две особенности.
Наше исследование показывает, что некоторые гаплотипы, связанные с изменчивостью признаков продуктивности в популяции интрогрессии, также проявляют значительные плейотропные эффекты.Хотя направление воздействия на различные черты в значительной степени соответствовало ранее описанным компромиссам между компонентами черт (Quintero et al., 2018; Griffiths et al., 2015; Reynolds et al., 2017), комбинированные эффекты некоторых интрогрессивных гаплотипы были связаны с положительной динамикой урожайности. Например, гаплотип, внесенный Ae. tauschii ssp. tauschii в блоке гаплотипа 2D хромосомы на уровне 65 964 778 – 66 124 103 п.н. было связано с увеличением длины, размера и количества зерен с умеренным положительным влиянием на урожай зерна.В блоке гаплотипа на хромосоме 7D, расположенном между 14 722 457 – 14 817 138 п.н., гаплотип Hap0_HW и AeT является общим для гексаплоидной пшеницы и Ae. tauschii и связанный с умеренным увеличением как количества колосков на колос, так и длины зерна, также был связан с наиболее значительным увеличением урожайности зерна. Анализ плеотропных эффектов интрогрессированных гаплотипов предполагает, что некоторые из них могут быть использованы в программах разведения для улучшения характеристик компонентов урожая без отрицательного воздействия на другие характеристики продуктивности.
Вследствие теплой зимы и ранней весны рост сорняков на полях с нулевой обработкой почвы происходит с опережением графика. Поля, не обработанные выгоревшими гербицидами прошлой осенью или в более ранний более засушливый период этой весной, на этом этапе могут иметь несколько крупных сорняков. Многим полям нужно время, чтобы просохнуть после недавних дождей, прежде чем они перестанут переносить движение, что позволит сорнякам стать еще крупнее и их сложнее уничтожить. Большой марестохвост может быть особенно проблематичным из-за сочетания устойчивости к глифосату и БАС в большинстве популяций.Прохладная погода может снизить активность гербицидов, воздействующих на корешок. Стандартное выжигание «глифосат + 2,4-D» вряд ли повлияет на большие растения канадского хвоща, исходя из недавней истории, и увеличение количества 2,4-D или добавление метрибузина также не обязательно приведет к эффективному контролю над этими растениями. Проблема здесь в том, что 2,4-Д несет всю нагрузку в отношении контроля над появившимися кочанами, и он недостаточно эффективен для борьбы с крупными растениями, даже с добавлением метрибузина.Хотя Sharpen более эффективен, чем 2,4-D, смесь глифосата и Sharpen также может становиться более разнообразной по эффективности по мере увеличения размера marestail. На полях с нулевой обработкой почвы, которые еще не обрабатывались гербицидами, подумайте о внесении изменений в программы выжигания, чтобы обеспечить полный контроль над крупными соевыми бобами до появления всходов сои без ГМО, Roundup Ready и LibertyLink. Послевсходовое применение глюфосината в соевых бобах LibertyLink наиболее эффективно на растениях кобылы, которые проросли после посадки, а не для борьбы с растениями, пережившими обработку гербицидом от выгорания.Предложения следуют.
– Средства от ожогов должны содержать по крайней мере два активных ингредиента с существенной активностью в отношении корешка. Наиболее рентабельным из них по-прежнему является 2,4-Д, для посадки которого потребуется 7 дней ожидания. Примеры: глифосат + 2,4-D + Sharpen или Zidua PRO; Грамоксон + 2,4-Д; Глюфосинат + 2,4-Д. Включение метрибузина рекомендуется для всех этих смесей, и его нельзя исключать для смесей 2,4-D с грамоксоном или глюфосинатом.
– там, где невозможно дождаться посадки, варианты могут быть менее эффективными или более дорогими. Лучшие подходы, отсортированные от наиболее до наименее эффективных: 1) глюфосинат + метрибузин + Sharpen или Zidua PRO; 2) глюфосинат + Sharpen или Zidua PRO; 3) Грамоксон + метрибузин + Sharpen или Zidua PRO.
– Переход на программу, которая включает Sharpen, может также привести к необходимости модификации остаточных гербицидов. Смеси Sharpen с остаточными продуктами, которые содержат флумиоксазин (Valor и т. Д.), Сульфентразон (Authority) или fomesafen (Prefix и т. Д.), Должны применяться по крайней мере за 14 дней до посева сои.Ожидание так долго, чтобы посадить, может не сработать, поскольку мы переезжаем в конце мая. Альтернативные остатки, которые можно использовать в смесях с Sharpen и применять в любое время до появления всходов сои, включают: Canopy Blend или Cloak DF + метрибузин; Матадор + метрибузин; Премиксы метолахлор / метрибузин (граница и т. д.). Общая норма метрибузина для всех этих веществ должна быть эквивалентна 8-10 унциям метрибузина 75 DF (возможно, меньше на песчаных почвах с низким содержанием органического вещества).
– На полях, засеянных соей Xtend, очевидно, есть возможность использовать XtendiMax, Engenia или FeXapan при выжигании, а затем, при необходимости, в качестве послевсходовых мероприятий.Дикамба, как правило, более эффективен, чем 2,4-Д, на корешке, особенно на крупных растениях, и комбинация глифосата и дикамбы может быть достаточно эффективной при сгорании. Мы наблюдали снижение контроля над более крупными растениями в смесях или дикамбе с остаточными продуктами, содержащими флумиоксазин (Valor и т. Д.) Или сульфентразон (Authority). Увеличение скорости дикамбы может уменьшить проблемы в этих смесях.
– обязательно оптимизируйте параметры распыления и адъюванты. Смеси, содержащие Sharpen и Zidua PRO, следует наносить с MSO.Грамоксон следует применять вместе с КОК. Грамоксон, глюфосинат и сафлуфенацил (Sharpen, Zidua) – это контактные гербициды, для которых требуются объемы распыления от 15 до 20 г / г и сопла, оптимизирующие покрытие. Подробности уточняйте на этикетках.
Эта информация обобщена в коротком видео, которое можно найти в нашем блоге (u.osu.edu/osuweeds) или на нашем канале Youtube https://youtu.be/orhtPNcn9GU. Мы также открыли страницу в Facebook для распространения информации специалистом OSU, «специалистами OSU по агрономии и борьбе с вредителями», и видео также размещается там.
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Понимание механизмов того, как сенсорная информация передается на двигательные нейроны, чтобы вызвать поведенческие реакции, является основной целью нейробиологии. Обычно один или несколько слоев интернейронов соединяют сенсорные рецепторы с двигательными нейронами. В зависимости от поведенческого контекста эти интернейроны обеспечивают синаптические входы для мотонейронов, генерируя различные двигательные паттерны в одних и тех же или перекрывающихся наборах мышц (Pearson, 1993; Büschges et al., 2011).
Нервная система пиявки – полезная модель для понимания роли интернейронов в тактильной обработке (Wagenaar, 2015). Небольшая сенсомоторная сеть у пиявки выявляет удивительно точные модели поведения. Пиявки производят различные двигательные паттерны, когда локально отклоняются от участков стимула, которые отделены друг от друга всего на 1 мм на стенке их тела (Baca, 2005; Kristan et al., 2005).
Пиявки имеют строго сегментированную нервную систему с одним ганглием на сегмент.Каждый ганглий представляет собой ансамбль из около 400 в основном парных нейронов, которые можно разделить на четыре различные функциональные категории: механорецепторы, двигательные нейроны, интернейроны и нейросекреторные нейроны (Wagenaar, 2015). Группа механорецепторов содержит 14 клеток 3 типов, которые, как принято считать, реагируют на определенный диапазон интенсивностей: 6 сенсорных (T) клеток активируются легким прикосновением, 4 сенсорных (P) клетки – умеренным давлением и 4 ядовитых (N). клетки сильными болезненными раздражителями. Каждый участок кожи иннервируется до 6 из этих механорецепторов (2 T, 2 P и 2 N клетки).Механосенсорные клетки реагируют на механическую стимуляцию кожи определенными импульсами, кодирующими местоположение, интенсивность и продолжительность тактильных стимулов (Baca, 2005; Thomson and Kristan, 2006; Kretzberg et al., 2016; Pirschel and Kretzberg, 2016). . Интернейроны – самая большая группа нейронов ганглия (Nicholls and Baylor, 1968). Большинство соединений механорецепторов с двигательными нейронами являются полисинаптическими через интернейроны (Kristan et al., 2005; Burrell, 2017).
Весь путь от сенсорного входа до моторного выхода локального изгибного рефлекса находится в одном ганглии.Для управления этим поведением была предложена трехуровневая сеть с прямой связью. Было решено, что четыре механорецептора одного типа (P-клетки) в качестве первого слоя обеспечивают вход в сеть (Kristan, 1982). Предполагалось, что простой межнейронный слой, состоящий из 25 интернейронов, получающих синаптический ввод от всех этих 4 P-клеток (Lockery and Kristan, 1990), распределяет сенсорный ввод между соответствующими 20 двигательными нейронами в выходном слое (Lewis and Kristan, 1998; Kristan, et al., 2005), которые контролируют мышечные движения.
Стимуляция внутриклеточным током одной P-клетки вызывает фиктивные паттерны мышечных движений, подобные (но меньшие) реакции локального изгиба, запускаемые при прикосновении к коже, тогда как стимуляция одной T- или N-клетки часто вызывает лишь незначительные сокращения мышц (Kristan, 1982 ; Зокколан, Торре, 2002). Таким образом, P-клетки были предложены в качестве основного кодировщика свойств тактильных стимулов и единственного значимого входа в локальную сеть изгибов. До недавнего времени только одна Р-клетка подвергалась электрическому стимулированию, чтобы вызвать реакции локального изгиба в большинстве экспериментов по изучению основной схемы (Baljon and Wagenaar, 2015; Frady et al., 2016; Томина и Вагенаар, 2017).
Недавние исследования предложили пересмотреть схему локального изгиба (Kretzberg et al., 2016; Pirschel and Kretzberg, 2016; Pirschel et al., 2018). Эти исследования показали, что, несмотря на классическую ассоциацию типов механорецепторов P и T с различной интенсивностью давления стимула, эти типы клеток реагируют на интенсивность стимула всех диапазонов. Более того, все Р- и Т-клетки несут информацию как об интенсивности стимула, так и о его местонахождении одновременно, путем мультиплексирования количества спайков и времени спайков.Эти находки предполагают оперативную роль Т-клеток в кодировании тактильной информации (Pirschel and Kretzberg, 2016), и поэтому этот тип клеток необходимо рассматривать для обеспечения соответствующих входных данных в сеть тактильной обработки пиявки. Сложное кодирование тактильных свойств механорецепторами порождает вопросы о том, как закодированная тактильная информация может быть декодирована простым межнейронным слоем или межнейронная проводка и обработка могут быть более сложными, чем предполагалось ранее.
В этом исследовании мы использовали визуализацию чувствительных к напряжению красителей (VSD) для изучения ответов интернейронов в локальной сети изгиба. Интернейроны пиявок реагируют на синаптический вход механорецепторов явными изменениями их мембранного потенциала, иногда сопровождаемыми очень маленькими потенциалами действия (<5 мВ, Nicholls and Purves, 1970; Lockery and Kristan, 1990; Marin-Burgin et al., 2008; Pirschel. и др., 2018). Последние достижения в области визуализации чувствительных к напряжению красителей предоставляют полезный инструмент для записи ответов большого количества нейронов одновременно с приличным временным разрешением на одной или обеих сторонах ганглия (Tomina and Wagenaar, 2017).Он позволяет отслеживать потенциалы действия и обнаруживать подпороговые изменения мембранного потенциала всего на несколько милливольт (Miller et al., 2012). Он использовался в нервной системе пиявки для идентификации синаптически связанных нейронов (Taylor et al., 2003), для изучения развития синаптических связей у эмбрионов (Marin-Burgin et al., 2008), для идентификации нейронов, участвующих в принятии решений. (Briggman, 2005; Briggman and Kristan, 2006), чтобы проанализировать эффекты торможения в цепи локального изгиба (Baca et al., 2008), чтобы определить подготовительную сеть для движения (Frady et al., 2016) и построить функциональные карты клеток, участвующих в наборе различного поведения (Tomina and Wagenaar, 2017).
В этой статье мы изучаем активность локальной сети изгиба, вызываемой либо электростимуляцией одного механорецептора давления, либо естественной тактильной стимуляцией кожи, включающей активацию 4–6 механорецепторов. С этой целью мы использовали визуализацию VSD для отслеживания ответов всех видимых интернейронов на вентральной стороне ганглия.Мы сосредоточились на вопросе о том, как локальные интернейроны изгиба реагируют на стимулы с разной интенсивностью, обеспечиваемые либо введением внутриклеточного тока в один механорецептор давления, либо тактильной стимуляцией кожи, которая активирует всю популяцию механорецепторов с перекрывающимися рецептивными полями. Здесь мы впервые показываем, что стимуляция одного механорецептора вызывает менее выраженную сетевую активность, чем естественная сенсорная стимуляция. Этот вывод подтверждает гипотезу о том, что схема локального изгиба является более сложной, чем простая трехуровневая сеть с прямой связью.
Взрослые медицинские пиявки-гермафродиты ( Hirudo verbana ) массой 1-2 г были получены от Biebertaler Leech Breeding Farm (Биберталь, Германия) и содержались при комнатной температуре в резервуарах с морской солью, разбавленной очищенной водой (1: 1000). ). Согласно немецким правилам, для этих беспозвоночных не требовалось одобрения институционального комитета по этике. Перед вскрытием животных анестезировали ледяным физиологическим раствором (Muller and Scott, 1981).Все эксперименты проводились при комнатной температуре. Для регистрации использовались два типа препаратов: изолированные ганглии, рассеченные из сегмента 10, и редуцированные препараты стенки тела из сегмента 9–11, в которых иннервация сегмента 10 оставалась нетронутой, так что естественные реакции интернейронов на стимулы, прикладываемые к коже, могли записываться. При препарировании стенки тела, как описано ранее (см. Pirschel and Kretzberg, 2016), кожа была рассечена пополам по дорсальной средней линии стенки тела, и ганглий 10 был извлечен из исходного положения в 3-м кольце сегмент 10 переместился в 5-е кольцо, где в коже было вырезано небольшое отверстие, открывающее доступ к ганглию (рис. 1А).Препараты прикрепляли булавками брюшной стороной вверх в покрытых сильгардом чашках, содержащих физиологический раствор. Ганглии освобождали от оболочки путем удаления оболочки глии с вентральной стороны ганглия, пакет за пакетом.
Рисунок 1 . Схема эксперимента, пример записи VSD и ответов ячейки. (A) Препарирование стенки тела ганглия пиявки (см. Pirschel and Kretzberg, 2016). Кожу рассекали пополам на дорсальной средней линии стенки тела и прикрепляли вентральной стороной вверх с небольшим отверстием, обеспечивающим доступ к ганглию.Тактильный стимул был предъявлен к 3-му кольцу по средней линии вентральной части (синий прямоугольник), в то время как ганглии были визуализированы с помощью записей VSD. На правой вставке показан кадр записи ганглия с помощью чувствительного к напряжению красителя с полным разрешением камеры (512 × 512 пикселей), покрывающим примерно 1 × 1 мм 2 . (B) Снимок изолированного препарирования ганглия среднего тела, сделанный с полным разрешением камеры (512 × 512 пикселей). Кружками обозначены интересующие области, соответствующие телам клеток (красный, фиолетовый и голубой).Клетки были обнаружены в двух разных слоях стопки с полным разрешением камеры. Положение стимулированной Р-клетки указано голубым кружком, а две клетки, ответы на которые показаны на панелях G и H, отмечены фиолетовыми кружками. (C) Тактильные стимулы применялись в течение 200 мс с низкой (35 мН, красный), средней (50 мН, желтый) и высокой (70 мН, фиолетовый) интенсивностью. Ответы сравнивали с контрольным условием (синий). (D) Импульсы внутриклеточного тока, используемые для стимуляции P-клеток, имитирующие ответы на слабую, среднюю и более высокую интенсивность.Длительность каждого импульса составляла 10 мс. (E, F) Внутриклеточно вызванные потенциалы действия (E) и одновременные записи VSD (F) Р-клетки в ответ на стимуляцию внутриклеточного тока, показанную в (D ). (G, H) Примеры сигналов VSD клетки Ретциуса (Rz) и AP-клетки (обе отмечены фиолетовым цветом в B ) показывают ответы на спайки стимулированной P-клетки (голубой в B , следы ответа в E, F ).
Мы использовали двухрежимную систему рычагов (Aurora Scientific, модель 300 B; Baca, 2005; Thomson and Kristan, 2006; Kretzberg et al., 2016) с размером наконечника для покера 1 мм 2 для применения ступенчатых стимулов давления с различной интенсивностью давления 35, 50 и 70 мН в течение фиксированной продолжительности 200 мс. В контрольном состоянии кожа не трогалась. Временной ход стимула показан на Рисунке 1С. Тактильные стимулы применялись от вентральной средней линии (отмеченной пунктирной линией на рисунке 1А) до среднего (3-го) кольца сегмента 10, которое определялось по расположению сенсиллы (Blackshaw et al., 1982). Синий прямоугольник на рисунке 1A показывает примерное место стимуляции.Запись VSD начиналась за 500 мс до тактильной стимуляции и длилась не менее 1 секунды.
Мы использовали стандартные методы внутриклеточной записи, как описано в исследовании Pirschel and Kretzberg (2016), для мониторинга и стимуляции P механорецепторных нейронов одновременно с записями VSD от всех видимых клеток на вентральной стороне ганглиев. Для записи использовались стеклянные электроды с сопротивлением от 20 до 40 МОм, заполненные ацетатом калия (3 М).Нейронные ответы записывались с частотой дискретизации 10 кГц и анализировались с использованием специально написанных сценариев MATLAB (MathWorks).
P-клетки могут быть однозначно идентифицированы по их характерным размерам и положению в ганглии, а также по их электрическим свойствам (Nicholls and Baylor, 1968). Текущие стимулы (рис. 1D), состоящие из 5, 7 и 8 сверхпороговых ступенчатых импульсов (3 нА, 10 мс), вводились для имитации последовательности импульсов Р-клеток в ответ на тактильную стимуляцию кожи низким (35), средним (50) и высокая (70 мН) интенсивность давления, как показано на Рисунке 1C.Для разработки этих цепочек импульсов Р-клеток мы использовали подмножество данных из Pirschel and Kretzberg (2016) и Kretzberg et al. (2016), в которых регистрировались ответы Р-клеток на тактильную стимуляцию в вентральной средней линии стенки тела пиявки. Согласно этому набору данных, P-клетки генерируют от 2 до 6 пиков (среднее значение = 4, медиана = 5) в ответ на 35 мН, от 2 до 8 пиков (среднее значение = 5, медиана = 7) для 50 мН и от 4 до 8 пиков. спайки (среднее значение = 5, медиана = 8) для 70 мН (см. Kretzberg et al., 2016, рисунок 3).Среднее число спайков и значения интервала между спайками учитывались при разработке протокола электрического стимулирования P-клеток, что приводило к стимуляции длительностью 10 мс с импульсом тока 3 нА временами [535, 570, 605, 668, 731] мс для низких значений. , [535, 570, 605, 640, 675, 763, 826] мс для среднего и [535, 570, 605, 640, 675, 710, 763, 826] мс для высоких значений давления. В наших экспериментах электрические стимуляции P-клетки были разделены временной задержкой 30 с, после чего следовало контрольное испытание без стимуляции (синие кривые на рисунках 1D – F).
Метод визуализации с помощью чувствительного к напряжению красителя использовался для мониторинга активности всех видимых нейронов на вентральной стороне ганглия в ответ на условия различной интенсивности стимула. Оболочку глии на вентральной стороне ганглиев удаляли и ганглии окрашивали 200 нМ красителем VF2.1.CL (λmax = 522 нм, λem = 535 нм, см. Miller et al., 2012). Последовательность изображений получали с помощью камеры CCD (Photometrics QuantEM: 512SC), установленной на микроскопе [Zeiss Examiner.D1, объектив планапохромат 20 x / 1.0 DIC (UV)] с частотой 94,5 кадра в секунду и разрешением 64 × 128 пикселей. Снимки изображений с полным пространственным разрешением камеры, 512 × 512 пикселей, были взяты с разной глубины в стопках, в зависимости от того, какие области интереса (ROI), представляющие тела отдельных клеток, были нарисованы вручную. На рис. 1A (правая вставка) и рис. 1B показаны снимки изображений ганглиев в полуинтактном препарате и изолированном ганглии, соответственно.
Мы следовали ранее разработанной процедуре рисования областей клеток, выравнивания изображений и нормализации для извлечения сигналов VSD из последовательности изображений (Fathiazar and Kretzberg, 2015).Этапы обработки более подробно описаны в следующих разделах.
Первым шагом анализа сигналов VSD было определение областей интересов клеток. Хотя максимальное пространственное разрешение камеры составляло 512 × 512 пикселей, записи с желаемой временной частотой почти 100 кадров в секунду могли быть достигнуты только с более низким пространственным разрешением 64 × 128 пикселей. Снимки изображений с полным разрешением камеры (512 × 512 пикселей), сделанные до или сразу после записи VSD, использовались только для определения областей интересов, характеризующих отдельные клетки.Благодаря расположению тел клеток на сферической поверхности ганглиев пиявки, мы идентифицировали нейроны на трех снимках с разной глубины в стеке. Области интересов с разной глубины были сопоставлены с одним выбранным снимком. На рис. 1В изображены интересующие области, представляющие тела клеток голубыми, пурпурными и красными кружками, обнаруженные в двух разных слоях стопки в образце эксперимента с VSD. Полученное изображение было уменьшено, чтобы соответствовать пространственному разрешению записей VSD (64 × 128 пикселей).
Чтобы извлечь следы отклика ячеек из последовательности изображений, мы отслеживали среднюю яркость пикселей внутри интересующих областей ячеек. Поскольку положения клеток могут незначительно изменяться со временем из-за перемещений клеток, ганглиев или препарирования кожи, определенные интересующие области могут не соответствовать фактическому положению клеток на всех последовательных кадрах, что приводит к так называемому артефакту движения. . Чтобы удалить этот артефакт, все последовательные кадры каждой записи были сопоставлены с шестым кадром с использованием метода оптического потока (Fathiazar and Kretzberg, 2015).
Метод оптического потока, однако, не может исправить экстремальные движения клеток, особенно в тактильных препаратах с прикрепленной стенкой тела. Во время разогрева некоторые ячейки были освобождены, что привело к смещению их первоначального местоположения. Это смещение чаще всего происходило при препарировании стенки тела, когда ганглии слегка подтягивались кзади, чтобы соответствовать небольшому отверстию, прорезанному в коже. В этом состоянии оболочка глии ганглия была удалена, в то время как некоторые клетки находились под напряжением.Поэтому ячейки, для которых рассчитанное поле потока показало экстремальное движение, были исключены из дальнейшего анализа (например, ячейки, отмеченные черным на рисунках 6G, 7B).
Абсолютный уровень сигнала каждого следа зависел от количества красителя, связанного с клеточной мембраной, и относительного положения клетки относительно линзы микроскопа. Клетки, расположенные ближе к микроскопу или с более высокой концентрацией красителя, выглядели более яркими на изображениях, имея более высокие значения сигнала.Следовательно, чтобы обеспечить возможность сравнения ячеек в разных экспериментах или в разных экспериментах, уровень сигнала каждой ячейки был нормализован к ее среднему уровню яркости, который был рассчитан путем усреднения уровня яркости по 30 кадрам перед началом стимуляции (ΔF / F¯ ).
Фотообесцвечивание со временем приводит к снижению уровня сигнала из-за разрушения красителя под действием света. Чтобы оценить эффект обесцвечивания, мы записали контрольную пробу без стимуляции после каждой последовательности записей со стимулами.Для каждой нестимулированной записи линейная линия, представляющая затухание обесцвечивания, была подогнана к трассе VSD пикселей в ROI. Затем мы удалили артефакт обесцвечивания из ответов клеток на стимуляцию, вычтя эту подобранную линию из контрольного испытания, аналогично (Fathiazar and Kretzberg, 2015). Обработанные сигналы VSD двух образцов клеток в ответ на стимуляцию внутриклеточных Р-клеток показаны на рисунках 1G, H.
Сигнал VSD зашумлен.Более низкая частота дискретизации (94,5 кадра в секунду) записей VSD по сравнению с внутриклеточными записями еще больше снижает временную точность сигнала. На рисунках 1E, F сравниваются внутриклеточные записи P-клетки с одновременными записями VSD. Чтобы обнаружить изменения мембранного потенциала клеток (<5 мВ в интернейронах), несмотря на значительный уровень шума, мы следовали процедуре, описанной в (Fathiazar et al., 2016). Вкратце, мы рассчитали базовый уровень сигнала VSD для каждой клетки путем усреднения контрольных испытаний без стимуляции.Этот базовый уровень каждой клетки вычитали из записей VSD в испытаниях со стимулированием, чтобы получить активность, индуцированную стимулом. Для снижения уровня шума мы применили фильтр скользящего среднего с размером окна в три кадра к сигналам, вычтенным из базовой линии. Затем мы применили основанный на статистике подход, описанный в (Fathiazar et al., 2016), для выявления статистически значимых отклонений от базового уровня в каждый момент времени. Для каждого временного интервала подсчитывалось количество испытаний, в которых сигнал отклонялся от базовой линии.Были обнаружены индуцированные стимулом значительные изменения, как кратко объясняется в следующих разделах.
Для каждой ячейки были объединены данные предварительно обработанных контрольных испытаний. На рис. 2А показана гистограмма отклонений всех контрольных испытаний от исходного уровня, рассчитанная для образца клетки AP. Мы рассчитали пороговые значения, разделяющие 2,5% самых низких значений (θ 1 ) и 2,5% самых высоких значений (θ 2 ) объединенных отклонений от базовой линии в контрольных испытаниях (черные линии на рисунках 2A, B). ).Эти пороговые значения применялись для выявления значительных отклонений от исходного уровня стимулированных испытаний (рисунки 2D, E). Для каждой временной точки отклонение от базовой линии сравнивалось с пороговыми значениями θ 1 и θ 2 . Если любое из этих пороговых значений было превышено, точка данных классифицировалась как значительно высокое или низкое значение.
Рисунок 2 . Обнаружение стимулирующих клеток. (A) Гистограмма отфильтрованных разностных сигналов AP-ячейки, объединенная в ходе шести испытаний (по 110 кадров в каждом) в контрольных условиях, нанесена на график в (B) .Пороговые значения θ 1 и θ 2 (черные вертикальные линии в A ) разделяли верхние 2,5% и нижние 2,5% (α = 0,05) значения в контрольных испытаниях. ( B , нижняя вставка) Карта активности, показанная в виде цветной линии со значениями от темно-синего (0) до желтого (6) (см. Цветовую полосу в C, F ), показывает, сколько из 6 испытаний ( B , верхняя панель) пересекли пороговые значения (черные горизонтальные линии). В черном поле указаны рамки 43–77 (см. E ). (C) Карта активности всех 93 выбранных клеток ганглия для шести испытаний в контрольных условиях. Каждая строка соответствует одной ячейке; например, строка 12 (в белом поле) соответствует карте активности ячейки AP, показанной в (B) , нижняя вставка. (D) Гистограмма отфильтрованных разностных ответов AP-клетки (нанесена на график E) на внутриклеточную стимуляцию P-клеток в течение шести стимулированных испытаний (110 кадров каждое) со стимулами средней интенсивности. Динамика подаваемого тока показана на рисунке 1D (желтая линия).Черные вертикальные линии в (D) и черные горизонтальные линии в (E) указывают пороговые значения, рассчитанные в контрольных условиях для определения значительных отклонений от базовой линии в стимулированных условиях (см. A, B ). ( E , верхняя вставка) Значения сигнала выше θ 1 и ниже θ 2 указывают на существенно разные ответы (α = 0,05). ( E , нижняя вставка) Карта активности ответов AP-клеток в стимулированных условиях. Временные рамки между началом внутриклеточного стимула (кадр 43) и смещением стимула плюс пять кадров (кадр 77) обозначены черным прямоугольником. (F) Карта активности 93 выбранных клеток в ганглии для шести испытаний (110 кадров в каждом) в условиях стимуляции. Клетки были отсортированы в соответствии с их последовательностью активации после появления стимула. По сравнению с контрольным условием (C) многие клетки показали более значительную активность в ответ на стимуляцию Р-клеток. На основе этих карт активности отдельные клетки были классифицированы как активированные стимулом, если они отвечали последовательно, по крайней мере, в одном кадре между началом внутриклеточного стимула (кадр 43) и смещением стимула плюс пять кадров (кадр 77). (G) Клетки в красных кружках были обнаружены как стимул, активированный со значением согласованности 4, что означает, что эти клетки имели по крайней мере один темно-зеленый (4), оранжевый (5) или желтый (6) пиксель в приведенном выше рисунке. упомянутый период карты деятельности. (H) Активированные стимулом клетки со значением консистенции 5 показаны красным; т.е. клетки с по крайней мере одним пикселем оранжевого (5) или желтого (6) цвета, индуцированные стимуляцией Р-клеток. (I) Клетки красного цвета были обнаружены с уровнем значимости α = 0.1 и критерий согласованности 5. Уровень значимости 0,1 означает, что пороговые значения, θ 1 и θ 2 , были рассчитаны для разделения 5% самого высокого и самого низкого значений соответственно, в результате чего большое количество нейронов классифицировалось как стимул активирован, чем при α = 0,05.
Чтобы отличить активность клеток от шумного фона, мы посчитали покадрово количество испытаний, показывающих значительные отклонения от базовой линии, как меру постоянно меняющейся активности в повторных испытаниях.Полученные числа для каждого временного интервала и каждой ячейки были объединены в карту активности. На нижних вставках фиг. 2B, E изображена карта активности для одного образца AP-клетки в контрольных и стимулированных условиях, соответственно, соответствующая 6 испытаниям, показанным над каждой вставкой. Цвет каждого пикселя на карте активности [от 0 (синий) до 6 (желтый)] указывает количество значительных отклонений от базовой линии. На Фигуре 2F показана карта активности ( I ( j, k )) 6 стимулированных испытаний для всех зарегистрированных клеток и Фигуры 2C для контрольных испытаний.Каждая строка ( j {1,…, 93}) соответствует отдельной ячейке, а столбцы ( k ϵ {1,…, 110}) представляют собой номера кадров. Номера кадров k ϵ {1,…, 110} соответствуют точкам выборки в диапазоне 0,07 < t <1,2 с. I ( j, k ) ϵ {0,…, 6} показывает, в скольких из 6 испытаний ячейка j в кадре k была активной. На основе этих карт активности отдельные клетки были классифицированы как «активированные стимулом», если суммарное значение по крайней мере одного кадра между началом импульсного стимула (точка выборки t = 0.5 с, кадр 43), а смещение стимула плюс 5 точек выборки (для стимуляции P-клеток со средней интенсивностью, t = 0,88 с, кадр 77, см. Черные прямоугольники на рисунках 2B, E, нижняя вставка) было равно или превышает значение критерия 5 из 6. Очевидно, более низкие значения согласованности или более высокие уровни значимости приводят к большему количеству клеток, классифицируемых как клетки, активируемые стимулом. На рисунках 2G – I сравниваются активированные стимулом клетки (отмечены красным), найденные для критериев согласованности 4 и 5 и для уровней значимости 0.05 и 0.1. В этой статье мы использовали относительно строгие значения критерия согласованности 5 из 6 испытаний и уровень значимости 0,05. Эти значения обеспечивают консервативную оценку клеток, активированных стимулом, за счет минимизации количества ложных срабатываний.
В качестве альтернативного метода идентификации активированных стимулом клеток мы применили тест Фридмана (Hollander et al., 2013; p <0.001), чтобы обнаружить, что клетки, отвечающие на стимулированные условия, значительно отличаются по сравнению с контрольными условиями. Этот тест является альтернативой повторному анализу ANOVA, но с использованием рангов, а не исходных значений данных. В этом тесте разница с базовыми значениями VSD, рассчитанными для каждого условия стимула, оценивалась отдельно для каждой ячейки. Затем ранги, полученные для всех клеток, были сгруппированы в соответствии с условиями стимула, которым они были вызваны. Нулевая гипотеза заключалась в том, что распределение рангов было идентичным для контрольного и исследуемого условий стимула.Если нулевая гипотеза отклонялась, оценивали, что ранги ответа исследуемого условия стимула значительно отличались от распределений рангов, полученных для контрольного условия, показывая значительный эффект стимуляции на ответ записанных клеток.
Для клеток, идентифицированных как активируемые стимулом, значительные различия в ответах нейронов на различные условия интенсивности стимула (включая контрольные условия) были протестированы с помощью теста Фридмана (Hollander et al., 2013; p <0,001), что более подробно описано в исследовании Pirschel and Kretzberg (2016). Как и прежде, ранги, полученные для всех клеток, были сгруппированы в соответствии с условиями стимула, которым они были вызваны. Здесь нулевая гипотеза заключалась в том, что распределение рангов было идентичным для всех стимулов. Если нулевая гипотеза отклонялась, оценивалось, что ранги ответа по крайней мере для одного условия стимула значительно отличаются от распределений рангов, полученных для других значений стимула, что свидетельствует о значительном влиянии стимуляции на реакцию активированных стимулом клеток.
Индивидуальные клеточные ответы на различные условия стимула сравнивали, вычисляя среднюю разницу с исходными значениями VSD (VSD¯). Усреднение выполнялось во временном окне, используемом для обнаружения значительной активации клеток (начало стимула до смещения плюс 5 кадров). Реакция клетки была помечена в соответствии со сравнением ее ответов на различные условия стимула как «увеличивается с интенсивностью стимула», если VSD¯low_stim
Затем мы применили тест множественного сравнения с апостериорной коррекцией (функция multcompare, набор инструментов статистики MATLAB) к таблице дисперсионного анализа, полученной с помощью теста Фридмана, для определения попарных значимых различий. Тип критического значения MATLAB по умолчанию (Tukey-Kramer; Milliken and Johnson, 2009) с уровнем значимости 0,05 использовался для проверки значимых различий между парами ответов VSD.Попарные значимые различия были рассчитаны между комбинационными парами контрольных условий и стимулированных условий (пары 0 против 35 мН | 0 против 50 мН | 0 против 70 мН), а также между комбинационными парами стимулированных условий (пары из 35 против 70 мН). .50 мН | 35 против 70 мН | 50 против 70 мН).
Чтобы оценить, насколько точно сигналы VSD отражают изменения мембранного потенциала, мы сравнили сигналы VSD одной клетки-образца с соответствующими внутриклеточными мембранными потенциалами.Мы зарегистрировали ответ AP клетки внутриклеточно при визуализации всего ганглия с VSD в препарате стенки тела. AP-клетки имеют относительно большие сомы по сравнению с соседними с ними клетками и поэтому могут быть надежно идентифицированы на разных препаратах. На рисунках 3A, C изображены внутриклеточные записи от AP-клетки и одновременно записанные ею сигналы VSD в ответ на различные условия стимулирования (как показано на рисунке 1C) низкого (35 мН), среднего (50 мН) и высокого (70 мН) давления. интенсивности, а также условие контроля (0 мН).Чтобы позволить прямое визуальное сравнение обоих типов записей, внутриклеточно записанный мембранный потенциал (рис. 3A) был повторно выбран на основе парадигмы экспозиции-считывания камеры (рис. 3B). Уровни сигнала VSD (рис. 3C) увеличивались аналогично зарегистрированным внутриклеточно градиентным изменениям мембранного потенциала (рис. 3A, B). Для статистического сравнения сигнала VSD с зарегистрированным внутриклеточно мембранным потенциалом аналогичные шаги предварительной обработки были применены к обоим типам данных. Исходные данные рассчитывались путем усреднения контрольных испытаний и вычитались из нормализованных ответов.Подсчет спайков был рассчитан на основе внутриклеточных записей в тот же интервал времени, который использовался для обнаружения активированных стимулом клеток (см. Раздел «Методика», «Карта активности»). Интенсивность стимула показала значительное влияние ( p <0,001, тест Фридмана) на различия VSD от исходного уровня (Рисунок 3F), а также на внутриклеточные измеренные различия мембранного потенциала от исходного уровня (Рисунок 3E) и количество спайков (Рисунок 3D). Для всех этих трех характеристик реакции значимые различия (α <0.05, тест множественного сравнения) были обнаружены между любыми стимулированными условиями и контрольными условиями (рисунки 3D – F). Более того, для регистрированных внутриклеточно дифференцированных изменений мембранного потенциала (рис. 3E) и количества спайков (рис. 3D) также были обнаружены значительные различия (α <0,05, тест множественного сравнения) между всеми комбинационными парами стимулированных условий, например, между средним и сильным условия интенсивности; в то время как сигналы VSD (рис. 3F) показали только существенные различия между слабой и сильной стимуляцией.Поскольку низкое отношение сигнал / шум записей VSD не позволяло надежно оценить количество спайков на основе оптических сигналов, все дальнейшие анализы проводились на основе градиентных изменений мембранного потенциала.
Рисунок 3 . Сравнение внутриклеточного мембранного потенциала и сигнала VSD той же клетки. (A) Мембранный потенциал AP-клетки регистрировали внутриклеточно одновременно с записями VSD (C) .В (A – C) записаны красные, желтые и пурпурные линии в качестве примеров ответов на тактильную стимуляцию с низкой, средней и высокой интенсивностью в полуинтактном препарате (как показано на рисунке 1C). Синие линии показывают пример реакции на контрольное условие. Черные линии обозначают базовую линию, рассчитанную как среднее значение всех трасс, записанных в контрольных условиях. (B) Вариант мембранного потенциала с временной пониженной дискретизацией, показанный в (A) , в соответствии с частотой дискретизации камеры. (D – F) Коробчатые диаграммы характеристик ответа, полученные для 14 испытаний в каждом из четырех условий стимула: (D) внутриклеточно обнаруженных спайков между началом стимула и смещением стимула плюс пять кадров, (E) внутриклеточно зарегистрированный мембранный потенциал отличия от исходного уровня и (F) VSD-сигнал отличия от исходного уровня.
Чтобы изучить вопрос о том, как интернейроны обрабатывают информацию тактильного стимула, передаваемую через механосенсорные нейроны, мы исследовали на первом этапе, как отдельный сенсорный нейрон влияет на сетевую активность.Мы регистрировали все видимые клетки на вентральной стороне ганглия с помощью чувствительного к напряжению изображения красителя во время одновременной стимуляции внутриклеточного тока одной Р-клетки. Внутриклеточно вводимые импульсы тока состояли из последовательностей импульсов тока, предназначенных для имитации последовательности импульсов Р-клеток в ответ на тактильные раздражения с четырьмя различными интенсивностями давления: контроль (0 мН), низкий (35 мН), средний (50 мН) и высокий. (70 мН) интенсивности давления (рис. 1D).
Наши данные были собраны в 6 различных экспериментах, по крайней мере, 24 испытания в каждом эксперименте, включая 6 испытаний каждого условия стимула: контроль (0 мН), низкий (35 мН), средний (50 мН) и высокий (70 мН). ) интенсивности давления, имитируемые внутриклеточно введенным током.В среднем 114 (максимум: 136, минимум: 93) из ~ 160 клеток на вентральной стороне ганглия пиявки были видны достаточно четко, чтобы можно было анализировать данные ДМЖП. Пример эксперимента с 93 проанализированными клетками показан на рисунке 1B (красные, голубые и фиолетовые круги). В образце VSD наблюдаются две относительно большие и надежно идентифицируемые клетки (одна клетка Ретциуса и одна AP-клетка, отмечены фиолетовым цветом на рисунке 1B) в ответ на внутриклеточную стимуляцию P-клетки (голубой на рисунке 1B, кривые ответа на рисунках 1E, F. ) показаны на рисунках 1G, H.
Шесть испытаний каждого условия интенсивности использовались в каждом из шести экспериментов для идентификации активированных стимулом нейронов с использованием метода, основанного на статистике (раздел «Обнаружение стимулированных клеток с использованием метода на основе статистики»), с одной стороны, и теста Фридмана ( раздел «Обнаружение стимулированных клеток с помощью теста значимости Фридмана»), с другой стороны (см. Таблицу 1). Для метода, основанного на статистике, относительно строгие параметры порогового значения (α = 0,05) и критерия согласованности (5 из 6 испытаний) привели к обнаружению значительных отклонений ответа от базовой активности примерно в 1/3 всех проанализированных клеток. для всех условий стимула.На рисунках 4B, C показаны два примерных эксперимента с 30 и 28 клетками зеленого, голубого, оранжевого и фиолетового цветов, которые были идентифицированы как стимулы, активируемые электрической стимуляцией P-клеток, имитирующей тактильный стимул средней интенсивности. При увеличении порогового значения и / или уменьшении критерия согласованности количество клеток, идентифицированных как клетки, активируемые стимулом, будет увеличиваться (подробное описание см. В разделе «Обнаружение клеток, активированных стимулом, с использованием метода на основе статистики» и на Рисунке 2).Тест Фридмана ( p <0,001) идентифицировал немного больше клеток (таблица 1) и подтвердил, что подобное количество клеток значительно реагировало на условия стимула.
Таблица 1 . Процент активированных стимулом клеток, вызванных электростимуляцией одной Р-клетки.
Рисунок 4 . Клетки, отвечающие на активность одиночных P-клеток. (A) Стандартная карта ганглия с клетками, окрашенными в соответствии с их опубликованными функциями (на основе Wagenaar, 2015): голубой, сенсорные нейроны; оранжевый – двигательные нейроны; зеленые, постсинаптические интернейроны к Р-клеткам; фиолетовые, нейросекреторные и частично охарактеризованные нейроны.Масштаб: ~ 100 мкм. (B, C) Два примера препаратов VSD, демонстрирующих клетки, активированные стимуляцией P-клеток со средней интенсивностью, окрашенные в соответствии с их предполагаемыми функциями (см. A ). Стимулированные Р-клетки обозначены треугольными стрелками. Активация была обнаружена с пороговым значением α = 0,05 и критерием согласованности 5 из 6. Клетки были помечены на основе их местоположения и размера по сравнению со стандартной картой ганглия (A).
Основываясь на расположении и относительных размерах клеток, некоторые из клеток были идентифицированы путем сравнения изображений VSD ганглиев (Рисунки 4B, C) со стандартной картой ганглиев (Рисунок 4A).Клетки, которые были классифицированы как активируемые стимулом с помощью нашего статистического метода, хорошо соответствовали литературным данным. В частности, мы обнаружили как клетки Ретциуса, так и клетки AP с относительно большими размерами клеток, клетки 157, 159, 161, 162, 169, 212, 218, которые Локери и Кристан (1990) описали как интернейроны локального изгиба, а также другие нейроны с опубликовали синаптические входы от P-клеток, таких как интернейроны 60, 61, 62 (Kristan et al., 2005; Kretzberg et al., 2016), клетки 151 (премоторный нейрон; Marín-Burgin and Szczupak, 2000) и клетка 251 ( частично охарактеризованный нейрон; Frady et al., 2016). Остальные P-активированные клетки включали предположительно клетки 204, 205, 208, о которых ранее сообщалось как P-активированные нейроны (Kristan et al., 2005), и клетки 261, 262 и 255 (премоторные нейроны; Fan et al., 2005), чьи ответы к механорецепторным входам ранее не сообщалось.
На рисунках 5A – D изображены карты активности всех клеток на рисунке 4C для трех условий стимула и условия контроля. Каждая строка отображает результаты для одной из проанализированных 136 ячеек за 110 записанных временных рамок (ось x).Каждый пиксель указывает количество значительных отклонений от базовой линии в 6 испытаниях с цветами в диапазоне от темно-синего (0 – значимая активация отсутствует) до желтого (6 – значимая активация во всех испытаниях). Например, пиксель в строке 6 и столбце 60 желтого цвета указывает на то, что номер ячейки 6 значительно отклонился от базовой линии во всех шести испытаниях во временном интервале 60. Строки карт активности на рисунках 5A – D были отсортированы по время их первого значительного отклонения от исходного уровня по крайней мере в 5 из 6 испытаний в условиях средней интенсивности (Рисунок 5B).На Фигуре 5F показано увеличенное изображение с Фигуры 5B (черный ящик) карты активности 28 стимулированных клеток, указанных на Фигуре 4C. Обратите внимание, что числа на Фигуре 5E не соответствуют стандартной карте ганглиев на Фигуре 4A, а соответствуют последовательности их активации после появления стимула в соответствии с номерами строк на Фигурах 5B, F.
Рисунок 5 . Влияние паттернов пиков Р-клеток на постсинаптические нейроны. (A – D) Карты активности всех клеток ганглия (E) для каждого условия стимуляции внутриклеточным током P-клеток, указанные в верхней части каждой панели, соответствующие различным условиям интенсивности стимула, представленные на рисунке 1D, отсортированные в соответствии с реакции клеток на стимуляцию средней интенсивности.Цвета (см. Цветовую полосу от 0 до 6) каждого пикселя указывают количество испытаний, для которых активность конкретной ячейки (строки) значительно отличалась от базовой в определенный период времени (столбец). Клетки были пронумерованы в соответствии с их последовательностью активации после начала стимуляции со средней интенсивностью. Расположение ячеек в первых 28 рядах обозначено зелеными цифрами в (E) . (E) Классы ответов активированных стимулом клеток в том же препарате, что и на фиг. 4C, обозначены разными цветами в соответствии с их паттернами реакции на стимулы.Цифры в E соответствуют номерам ячеек на карте активности панели (A – D) . Голубой: внутриклеточно стимулированные Р-клетки. Желтый: активированные стимулом клетки со значительно различающимися (тест Фридмана, p <0,001) ответами на различные условия стимула со средним сигналом VSD, последовательно увеличивающимся с увеличением интенсивности стимула. Оранжевый: активируемая стимулом клетка со значительно различающейся реакцией на различные условия стимула со средним сигналом VSD, последовательно уменьшающимся с увеличением интенсивности стимула.Пурпурный: активируемые стимулом клетки со значительно различающимися ответами на различные условия стимула, но без монотонной зависимости сигнала VSD от интенсивности стимула. Белый: активированные стимулом клетки, чьи ответы на разные стимулы существенно не различались. (F) Увеличенное изображение прямоугольного окна, соответствующего строкам 1–29 и столбцам 43–78 карты активности в (B) .
Карты активности, полученные для различных стимулированных условий, сильно похожи друг на друга (рисунки 5A – C), что соответствует наблюдению очень сопоставимого количества активированных стимулом клеток, обнаруженных при различной интенсивности стимула (таблица 1).Эти сходства, вероятно, вызваны сравнимыми паттернами пиков Р-клеток, вызванными нашей стимуляцией, имитирующей ответы Р-клеток на разную интенсивность прикосновения (пять импульсов для низкой интенсивности, семь для средней и восемь для условий более высокой интенсивности). Более того, из-за низкого отношения сигнал / шум сигналов VSD, тонкие различия в постсинаптических ответах могут не проявляться четко. Однако, несмотря на визуальное сходство карт активности, полученных для трех стимулированных условий, расчет количества значимых активаций по крайней мере в 5 из 6 испытаний (желтые и оранжевые пиксели) показал, что активность клеток возрастает с увеличением интенсивности смоделированного давления прикосновения, используемого для внутриклеточная стимуляция Р-клеток.Для активированных стимулом клеток (первые 28 строк на рисунках 5A – C) было обнаружено, что общее количество временных рамок 272, 291 и 305 значительно отличается от исходного уровня по крайней мере в 5 из 6 испытаний для трех возрастающих интенсивностей давления стимула. . Напротив, в контрольных условиях ни один из временных интервалов не соответствовал этому критерию ни для одной из первых 28 ячеек (рис. 5D).
Влияние различных условий интенсивности стимула на нейронные ответы активированных стимулом клеток было дополнительно протестировано с помощью парного теста множественного сравнения (подробное описание см. В разделе «Выявление различий значимости между условиями стимула с использованием теста значимости Фридмана»).Большинство клеток, идентифицированных как активируемые стимулом, значительно различались по крайней мере между одной парой стимулированных условий и контролем с использованием теста множественного сравнения. В примере эксперимента, показанном на фигурах 4C и 5, 23 из 28 активированных стимулом клеток вызвали значительно разные ответы VSD в зависимости от условий стимула (рисунок 5E, желтый, оранжевый и пурпурный) согласно тесту Фридмана ( p <0,001). Из этих 23 клеток со значительно различающимися ответами 16 клеток показали попарно значимые ответы между стимулированными и контрольными условиями в тесте множественного сравнения, но ни одна из этих клеток не показала существенно разные ответы между любой комбинационной парой стимулированных условий.Тем не менее, было обнаружено, что среднее изменение сигнала VSD во время стимуляции прогрессивно увеличивается в 11 клетках (желтый на рисунке 5E) и снижается в 1 ячейке (оранжевый на рисунке 5E) с увеличением интенсивности стимула. Однако некоторые из активированных стимулом клеток (пурпурный на рисунке 5E) не показали какого-либо последовательного увеличения или уменьшения средних сигналов VSD, несмотря на их существенно разные ответы на различные условия стимула.
После характеристики влияния отдельной сенсорной клетки на активность сети, тактильные стимулы прикладывались к коже с контрольной (0 мН), низкой (35 мН), средней (50 мН) и высокой (70 мН) интенсивностью давления. длительностью 200 мс (рис. 1С).Ранее было показано, что локальная тактильная стимуляция в вентральной средней линии вызывает спайковые ответы по крайней мере в 4 механорецепторах (2 Т и 2 Р-клетки, Pirschel and Kretzberg, 2016). Эти тактильные раздражения кожи вызывали аналогичные или немного более слабые реакции Р-клеток, которые вызывались инъекциями электрического тока, используемыми в разделе «Реакции интернейронов, слабо зависят от интенсивности внутриклеточной стимуляции одиночной Р-клетки». Например, стимуляция кожи интенсивностью 50 мН вызвала 7 или менее спайков в каждой из идентифицированных P-клеток.
Мы провели тактильный эксперимент с четырьмя различными препаратами, по крайней мере, с 24 попытками в каждом эксперименте (по 6 испытаний для каждого стимула и контрольного условия). В среднем 106 (максимум: 119, минимум: 95) нейронов были видны достаточно для анализа данных. Для определения интернейронов, участвующих в тактильной обработке, тот же статистический метод, что и раньше (снова с уровнем значимости α = 0,05 и согласованным критерием активации 5 из 6 испытаний), был применен к ответам клеток VSD. В отличие от электростимуляции одиночной Р-клетки, процент активированных стимулом клеток сильно зависел от интенсивности стимула и варьировался от 40% для 35 мН до 71% для 70 мН (Таблица 2).Увеличение процента стимулированных клеток с увеличением интенсивности стимула подтверждено классификацией, основанной на тесте Фридмана (таблица 2).
Таблица 2 . Процент клеток, активированных стимулом, вызванных тактильной стимуляцией кожи.
На рисунке 6G показан пример изображения VSD в эксперименте с тактильной стимуляцией. В этом препарате была проанализирована активность 102 из ~ 160 нейронов на вентральной поверхности ганглия, из которых было обнаружено, что 14 нейронов (показаны черным) перемещаются из своего положения в последовательных кадрах (экстремальный артефакт движения) и поэтому были исключены из дальнейшие анализы.Из оставшихся 88 клеток (красный и синий) ответы 50 клеток на среднюю интенсивность (красный цвет) были классифицированы как стимулы, активируемые методом, основанным на статистике.
Рисунок 6 . Интернейроны, участвующие в тактильной обработке и влиянии интенсивности стимула на их деятельность. (A, B) Ответы двух пробных ячеек, ячейки Ретциуса и ячейки AP (обозначены в G ) на ступенчатые стимулы давления с различной интенсивностью 0, 35, 50 и 70 мН в течение фиксированной продолжительности 200 мс указано на верхних панелях (C – F) (см. рисунок 1C). (C – F) Карты активности всех клеток ганглия (красный и синий в G ) для каждого условия тактильной стимуляции, указанные в верхней части каждой панели. (G) Активированные стимулом клетки (красные) были обнаружены из всех видимых клеток ганглия (синий и красный) по их ответам на условия средней интенсивности (50 мН, E ). Пороговое значение α = 0,05 и критерий согласованности 5 из 6 применялись для обнаружения активности. Клетки, обозначенные черным, подвергались экстремальным движениям и были исключены из дальнейших анализов. (H) Классы ответов активированных стимулом клеток обозначены разными цветами в соответствии с их паттернами реакции на стимулы. Числа в (H) соответствуют номерам ячеек в первых 51 строке карты активности на панели (C – F) . Желтый: активированные стимулом клетки со значительно различающимися (тест Фридмана, p <0,001) ответами на различные условия стимула со средним сигналом VSD, последовательно увеличивающимся с увеличением интенсивности стимула.Оранжевый: активированные стимулом клетки со значительно различающимися ответами на различные условия стимула со средним сигналом VSD, последовательно уменьшающимся с увеличением интенсивности стимула. Пурпурный: активируемые стимулом клетки со значительно различающимися реакциями на различные условия стимула, но без постоянной зависимости сигнала VSD от силы стимула. Белый: клетки, которые были классифицированы как активируемые стимулом, но которые не показали существенно различающихся ответов в зависимости от условий стимула.
Для дальнейшего анализа влияния интенсивности стимула на ответы нейронов мы рассчитали карту активности для каждого состояния контрольной (0 мН), низкой (35 мН), средней (50 мН) и высокой (70 мН) интенсивностью давления (рисунки 6C – F). Как и раньше, каждая строка обозначает график активности одной клетки, отсортированный по их активации в ответ на стимуляцию средней интенсивности, а желтые пиксели отображают последовательную значительную активацию клеток во всех шести испытаниях. Карты активности показывают, что некоторые клетки ответили в течение одного или двух кадров сразу после начала стимула, что указывает на то, что они получили прямой ввод механорецепторов.В других клетках последовательные ответы начались значительно позже, предполагая косвенный ответ на спайки механорецепторов, вызванные активацией сети. Активность многих клеток увеличивалась по сравнению с базовой линией на протяжении всей продолжительности стимула (200 мс) и даже после смещения стимула. Некоторые клетки, например, клетки с номерами 45–51 на карте активности (обозначены стрелкой на рисунке 6E), по-видимому, реагировали на смещение стимула, а не на начало.
Увеличение интенсивности стимула давления увеличивало продолжительность и / или амплитуду ответов клеток.Сравнение карт активности при разной интенсивности давления показало, что количество значимых отклонений от базовой линии (количество оранжевых и желтых пикселей) увеличивалось с увеличением интенсивности стимула. В дополнение к тому, что большее количество клеток становилось активными (таблица 2), многие клетки сильнее реагировали на более высокую интенсивность давления, например, два примера клеток, показанные на фигурах 6A, B, для которых сигнал VSD явно увеличивался с увеличением интенсивности давления стимула. Увеличилась продолжительность ответа сети, т.е.g., большее количество клеток продолжало отвечать после смещения стимула в условиях высокой интенсивности давления (70 мН), чем в условиях средней (50 мН) и низкой интенсивности (35 мН).
В среднем, различная интенсивность давления стимула вызывала существенно разные ответы (критерий Фридмана, p <0,001) в 54% проанализированных клеток в 4 различных препаратах. Эти клетки предположительно могут быть задействованы в задачах распознавания интенсивности прикосновения. На рисунке 6H 48 нейронов (окрашенных в желтый, оранжевый и пурпурный цвета) давали существенно разные ответы на разные условия в соответствии с тестом Фридмана.В 23 из этих клеток (желтый цвет на фиг. 6H) средние значения ответа VSD прогрессивно увеличивались, а в 7 из этих клеток (оранжевый на рисунке 6H) средние значения ответа VSD постепенно уменьшались с увеличением интенсивности тактильного стимула. Применение теста множественного сравнения к 48 нейронам, окрашенным в желтый, оранжевый или пурпурный цвет на рисунке 6H, выявило 27 клеток, дающих существенно разные ответы между парами условий стимула, и 7 из них также демонстрируют значительно разные ответы, по крайней мере, между одной парой стимулированных условий. , е.г., между слабым и сильным раздражением.
Сравнивая результаты двух предыдущих разделов, мы обнаружили, что тактильная стимуляция кожи вызывает более высокую сетевую активность, чем электрическая стимуляция одной Р-клетки. Фактически, даже самая низкая интенсивность прикосновения активирует значительно больше клеток, чем любая интенсивность стимула, имитируемая электрической индуцированной цепочкой импульсов в одной Р-клетке (сравните таблицы 1, 2).Чтобы позволить прямое сравнение интернейронов, активируемых электрической стимуляцией одиночных Р-клеток, с одной стороны, и тактильной стимуляцией кожи, с другой стороны, оба типа стимуляции были применены к одному и тому же препарату, как показано на рисунке 6. Из-за фототоксичности красителя, нам пришлось ограничить наше сравнение одним условием интенсивности, средней интенсивностью 50 мН.
Активированные стимулом нейроны определяли на основе тех же статистических условий, что и в других экспериментах (α = 0.05 со значением консистенции 5 из 6). В то время как стимуляция кожи средней интенсивностью давления активировала 50 из 88 проанализированных клеток, было обнаружено, что только 22 нейрона последовательно реагировали на стимуляцию одиночных Р-клеток (таблица 3, желтые и коричневые клетки на фигурах 7A, B). Очень похожие числа были получены для теста Фридмана ( p <0,001, таблица 3). Однако оба статистических теста не выявили идентичных, но существенно перекрывающихся групп активированных стимулом клеток (таблица 3, строка 4).По сравнению с обоими статистическими подходами, метод, основанный на статистике, показал более высокий процент активированных Р-клеток клеток, которые также были классифицированы как активируемые стимулом для тактильной стимуляции (таблица 3, столбец 3), что предполагает более высокую согласованность между результатами. Как и ожидалось (см. Раздел «Обнаружение клеток, активируемых статистикой с использованием метода, основанного на статистике»), большее количество клеток было классифицировано как активируемых стимулом при ослаблении критерия согласованности до 4 из 6, но доля примерно в два раза больше клеток, активируемых тактильным воздействием. по сравнению с одноклеточной стимуляцией оставалась постоянной (таблица 3).Примечательно, что количество клеток, классифицируемых как активируемые стимулом для внутриклеточной стимуляции Р-клеток на основе ослабленного критерия 4 последовательных ответов (37 клеток), было все же ниже, чем количество клеток, которые, как было установлено, активируются при тактильной стимуляции с более ограниченным критерием. 5 последовательных ответов (50 ячеек).
Таблица 3 . Сравнение количества нейронов, управляемых тактильной стимуляцией кожи, с электрической стимуляцией одной Р-клетки.
Рисунок 7 .Сравнение интернейронов, участвующих в тактильной обработке, с постсинаптическими интернейронами P-клеток. (A, B) Активированные стимулом клетки (желтые, коричневые) были обнаружены из всех видимых клеток в ответ на стимуляцию (A), P-клеток и (B), тактильную стимуляцию. Клетки, активированные обоими типами стимулов, показаны желтым цветом, клетки, отвечающие только на один конкретный тип стимуляции, показаны коричневым ( A : только стимуляция P-клеток, B : только тактильная стимуляция).Стимулированные P-клетки показаны голубым цветом в (A) . Пороговое значение α = 0,05 и критерий согласованности 5 из 6 применялись для обнаружения активности. (C) Клетки, активированные по крайней мере одним типом стимула, показанным в A, B , были окрашены в соответствии с их предполагаемыми функциональными ролями, как показано на рисунке 4A. Голубой: сенсорные нейроны; Оранжевый: двигательные нейроны; Зеленый: интернейроны; Фиолетовый: нейросекреторные и частично охарактеризованные нейроны.
Используя наш стандартный способ идентификации активированных стимулом клеток (со значением согласованности 5 из 6), некоторые из этих активированных стимулом клеток могут быть отнесены к хорошо известным типам клеток и соответственно помечены на рисунке 7C путем сравнения изображения VSD. со стандартной картой ганглия (рис. 4А).Кроме того, клетки были окрашены, чтобы указать их функциональную роль в ганглии, предложенную (Wagenaar, 2015) в соответствии с рисунком 4A. Например, семь предполагаемых механосенсорных нейронов, идентифицированных по их расположению и относительным размерам в ганглии, были отмечены голубым цветом. Точно так же нейросекреторные и частично охарактеризованные нейроны, включая клетки Ретциуса, клетки AP и клетки 251, были окрашены в фиолетовый цвет, а моторные нейроны – в оранжевый. Остальные клетки с относительно меньшими клеточными телами предположительно являются интернейронами, которые активируются либо естественной стимуляцией прикосновения, либо однократной электрической стимуляцией Р-клетки и были отмечены зеленым цветом.
16 клеток (таблица 3, желтый на фиг. 7A, B) были активны в ответ на оба типа стимуляции, механическое давление, прикладываемое к коже, и текущую инъекцию в P-клетку. Сравнивая изображение VSD со стандартной картой ганглия (рис. 4A), некоторые из этих клеток можно отнести к хорошо известным типам клеток; например, ячейки Ретциуса, ячейки AP, ячейки AE и ячейки 251 (ячейки, обозначенные на рисунке 7C). Остальные клетки, указанные как активные в ответ на оба типа стимуляции на фиг. 7A, B, предположительно могут включать ранее известные локальные интернейроны изгиба (159, 161, 162, 169, 212, 218; Lockery and Kristan, 1990), другие нейроны, получающие синаптические входы от P-клеток (204, 208; Kristan et al., 2005) и премоторный нейрон (клетка 262, Fan et al., 2005).
7 клеток (таблица 3 и коричневый цвет на фиг. 7A) были активны исключительно во время стимуляции током P-клеток, включая N-клетку, которая была идентифицирована по ее расположению и относительно большим спонтанным спайкам. Две клетки, клетка 251 и одна клетка в переднем латеральном пакете, были активны во время состояния стимуляции P-клеток, но из-за их экстремального движения их активность нельзя было изучить в ответ на тактильную стимуляцию. Остальные клетки включали два неизвестных нейрона в заднем пакете, предположительно премоторные нейроны 255 и 261 (Фигуры 7A, C), а также клетку 62 (постсинаптический нейрон для P-клетки, Kretzberg et al., 2016) и интернейрон в передне-латеральном пакете еще предстоит идентифицировать.
34 клетки (таблица 3 и коричневые на фиг. 7B) были активны во время тактильной стимуляции, но не проявляли значительной активности в ответ на текущую стимуляцию одной Р-клетки. Помимо 5 механорецепторов, клетки, специфически реагирующие на тактильную стимуляцию кожи, предположительно включают одну частично охарактеризованную клетку (251), два мотонейрона (одна CV и одна HE) и 27 интернейронов, которые еще предстоит идентифицировать.
Мы использовали визуализацию чувствительных к напряжению красителей, чтобы изучить ступенчатую активность локальных интернейронов изгиба в зависимости от условий интенсивности стимула на двух разных препаратах. В изолированных ганглиях среднего тела одна Р-клетка стимулировалась электрически, а в полуинтактных препаратах к коже предъявлялись естественные сенсорные стимулы. Одиночная Р-клетка стимулировалась внутриклеточно с помощью последовательности импульсов тока, имитирующих ответы Р-клеток на естественные прикосновения. Эти эксперименты позволили нам напрямую сравнить эффекты стимуляции одного механорецептора в качестве входа в сеть с эффектами популяции механорецепторов, активируемых тактильной стимуляцией.
Все анализы, представленные в этом исследовании, основывались на оценке постепенных изменений мембранного потенциала на основе сигналов VSD, полученных для отдельных нейронов. Из внутриклеточных записей известно, что во многих интернейронах на медленные, ступенчатые изменения мембранного потенциала накладываются небольшие всплески (Lockery and Kristan, 1990; Kretzberg et al., 2016; Pirschel et al., 2018). Амплитуды этих «колосков» в соматических записях обычно ниже 5 мВ, что очень затрудняет их надежное обнаружение в оптических сигналах VSD.Хотя большие шипы, например, клеток Ретциуса (рис. 1G) и механорецепторов четко отражались в сигналах VSD, не все маленькие шипы можно было обнаружить. В частности, во время сенсорной стимуляции, когда сигнал VSD был подвержен дополнительным артефактам движения, низкая частота дискретизации (94,5 Гц) и низкий уровень отношения сигнал / шум сигналов VSD (см. Рисунки 1E, F) позволили оценить только ступенчатые изменения мембранного потенциала в большинстве клеток.
Хотя SNR и надежность наших изображений VSD были сопоставимы с другими исследованиями (Frady et al., 2016), не все постсинаптические интернейроны, идентифицированные в этом исследовании, были последовательно классифицированы как стимулирующие клетки во всех препаратах. Одной из основных причин этого была ограниченная видимость изображений VSD. Из ~ 160 нейронов на вентральной стороне ганглия в среднем только 101 нейрон был достаточно видимым для дальнейшего анализа. Некоторые нейроны, особенно с более мелкими клеточными телами, расположенными ниже или очень близко к более крупным клеткам, не были четко видны на изображениях VSD с низким пространственным разрешением 64 × 128 пикселей.Более того, удаление оболочки глии, необходимое для нанесения красителя VSD, вызывало смещение клеток, создавая дополнительный источник вариабельности между препаратами.
Второй причиной не обнаружения всех ожидаемых клеток во всех экспериментах были относительно строгие пороговые значения и критерии согласованности, применяемые для отделения ответов клеток от базовой активности. Активность клетки должна была значительно отклоняться (α = 0,05) от базовой активности по крайней мере в 5 из 6 стимулированных испытаний в точно такие же временные рамки.Тест Фридмана обнаружил такую же большую перекрывающуюся группу клеток, активируемых стимулом (таблица 3). Ослабление критериев подхода, основанного на статистике, привело к большему количеству клеток, классифицированных как активируемые стимулом (рис. 2, таблица 3), но с повышенным риском ложноположительных результатов.
В-третьих, хотя положения тел клеток в ганглии относительно фиксированы, они иногда меняют положение. Следовательно, более строгая классификация типов клеток и картирование клеток в препаратах требуют дополнительных физиологических или анатомических данных.
Более того, методологические ограничения в удалении двух основных артефактов сигналов VSD, а именно артефакта обесцвечивания и движения клеток, могли поставить под угрозу классификацию некоторых реакций, активируемых стимулом. Затухание обесцвечивания – это нелинейный и стохастический процесс, который можно аппроксимировать линейной моделью для наших коротких записей в соответствии с (Fathiazar and Kretzberg, 2015). Однако некоторые нелинейные эффекты отбеливания могли остаться. Аналогичное методологическое ограничение применялось к методу оптического потока, который, возможно, не смог полностью устранить артефакт движения в некоторых случаях и, следовательно, мог привести к неправильной классификации некоторых ячеек, даже несмотря на то, что мы исключили ячейки с сильными артефактами движения из нашего анализа.
Мы исследовали ответы постсинаптических нейронов на различные паттерны пиков одной Р-клетки, имитирующие типичные ответы на три различные интенсивности давления при тактильной стимуляции кожи. Стимуляция Р-клеток состояла из последовательности импульсов из 5, 7 и 8 шагов тока, каждая из которых запускала одиночный спайк, с синхронизацией, подобной ответам Р-клеток на тактильную стимуляцию низкой, средней и высокой интенсивности.Эти три разных входа, однако, запускали очень похожие карты активности VSD (Рисунок 5), предполагая, что ответ одной P-клетки на тактильные стимулы разной интенсивности давления не обязательно вызывает существенно разные ответы в большинстве постсинаптических нейронов. Несмотря на это сходство, некоторые клетки постоянно увеличивали свои ответы с увеличением интенсивности стимула. Например, клетки с номерами 40-50 показали поздние ответы, происходящие через несколько десятков миллисекунд после смещения стимула в условиях высокой интенсивности (рис. 5C).Для сравнения, эти поздние ответы были намного слабее в условиях средней интенсивности (рис. 5В). Поскольку простая сеть с прямой связью предсказывает, что ответы интернейронов будут происходить намного быстрее, чем через несколько десятков миллисекунд после последнего всплеска входного сигнала, эти результаты могут указывать на то, что полисинаптические соединения или петли обратной связи приводят к задержанным ответам интернейронов на стимуляцию высокой интенсивности.
Постсинаптические нейроны, идентифицированные в этом исследовании, совпадают и дополняют предыдущие результаты.И клетки Ретциуса, и клетки AP были относительно большими по сравнению с соседними клетками, и их можно было легко обнаружить на разных препаратах. Согласно исследованию Lockery и Kristan (1990), 13 из 17 (8 парных и 1 непарный) локальных интернейронов изгиба расположены на вентральной стороне ганглия. Хотя не все из этих 13 интернейронов с локальным изгибом были идентифицированы в каждом из наших экспериментов (см. Раздел «Оценка методов»), все эти клетки были обнаружены путем объединения активированных стимулом клеток всех 6 препаратов.Более того, ранее сообщалось о нескольких клетках, для которых синаптический вход от P-клеток был ранее зарегистрирован, а именно 208, 204, 205 (Kristan et al., 2005), 61, 62 (Kretzberg et al., 2016) и 151 (Marín-Burgin и Szczupak, 2000), также были обнаружены в препаратах. Кроме того, наш анализ VSD выявил некоторые интернейроны в заднем пакете как клетки, активируемые стимулом, для которых ранее не сообщалось об ответах на ввод механорецепторов. Эти клетки предположительно могут быть парами 261, 262 и 255, чьи связи с двигательными нейронами были обнаружены с помощью инъекций красителя (Fan et al., 2005), дополнительно связывая сенсорные слои с двигательными нейронами.
Сравнение клеток, активированных одной Р-клеткой (рис. 7А) и тактильной стимуляцией кожи (рис. 7В), показывает, что многим интернейронам для активации требовался полный сенсорный ввод от тактильной стимуляции (34 коричневых клетки на рис. 7В). Большая сетевая активность, управляемая популяцией механорецепторов, по сравнению с одиночной P-клеткой, может быть признаком более сильных моторных ответов на выходе сети.Эти результаты согласуются с предыдущим сообщением Zoccolan и Torre (2002) о том, что одновременная стимуляция P- и T-механорецепторов вызывала двигательные реакции в 2 раза сильнее, чем одиночная стимуляция P-механорецепторов. Учитывая количество активных сенсорных нейронов в ответ на локальный тактильный стимул (4–6: 2 Т и 2 Р-клетки с перекрывающимися рецептивными полями, а также две N-клетки для более сильных стимулов) и при стимуляции одиночных Р-клеток (1, 2: стимулированная P-клетка и, возможно, спонтанно активная N-клетка), большее количество активированных интернейронов в тактильном эксперименте можно объяснить одной из следующих гипотез: (1) Некоторые интернейроны получают постсинаптические сигналы от других сенсорных нейронов, чем электрически стимулированные P-клетки. , е.г., из Т-клеток. (2) Некоторые интернейроны реагируют на определенные паттерны активации подмножества сенсорных нейронов, например, как временные процессоры или детекторы совпадений, специфически реагируя на согласованные входные сигналы от двух или более сенсорных клеток. (3) Интернейроны также были активны в ответ на стимуляцию одиночных Р-клеток, но активность была сильнее в тактильном эксперименте из-за интеграции большего количества входных сигналов механорецепторов, что приводило к более деполяризованным или гиперполяризованным значениям и, следовательно, к постоянным (в минимум в 5 из 6 испытаний) превышение пороговых значений (θ 1 и θ 2 ), чем для стимуляции одиночных P-клеток.
Эти гипотезы необходимо оценить в дальнейших исследованиях VSD и внутриклеточной записи, стимулирующих два или более механорецепторов согласованным образом по сравнению с тактильной стимуляцией кожи. Эти эксперименты также помогут интерпретировать, что некоторые клетки, например, два неизвестных нейрона в заднем пакете (рис. 7A), были активны во время P-стимулированного состояния, но не проявляли значительной активности в ответ на тактильную стимуляцию кожи. Это открытие могло быть связано с нелинейной интеграцией входов от различных механорецепторов, например.g., ингибирующие эффекты некоторых механорецепторов.
Наши результаты показывают, что ответы интернейронов значительно различались в зависимости от условий стимула, подтверждая их роль в обработке тактильной информации. В частности, в этом исследовании были идентифицированы три различных типа ответа. Первая группа интернейронов (желтые клетки на рисунке 6H) ответила прогрессирующей деполяризацией мембранного потенциала на повышенную интенсивность тактильной стимуляции.Поскольку механорецепторы также вызывают большее количество спайков в ответ на повышенную интенсивность давления стимула, эту группу интернейронов можно рассматривать как медленные интеграторы пресинаптических спайков сенсорных нейронов, как предполагалось в нашем предыдущем исследовании для внутриклеточно регистрируемой клетки 157 (Kretzberg et al. , 2016). Те же рассуждения применимы к меньшей группе клеток, демонстрируя последовательно уменьшающиеся сигналы VSD с увеличением интенсивности стимула (оранжевые клетки на рисунке 6H). Эти клетки прогрессивно гиперполяризованы, что позволяет предположить, что они интегрируют тормозные постсинаптические потенциалы, прямо или косвенно индуцируемые спайками механорецепторов.
Для третьей группы интернейронов (пурпурные клетки на рисунке 6H) ответы значительно различались в зависимости от условий интенсивности стимула, но без какого-либо последовательного увеличения или уменьшения с увеличением интенсивности давления стимула. Следовательно, эти интернейроны, по-видимому, реагировали разными временными паттернами реакции в зависимости от условий стимула. Клетка без пиков 151 является примером таких интернейронов, подробно изученных ранее с помощью внутриклеточных записей (Marín-Burgin and Szczupak, 2000).Эта клетка получает полисинаптические входы от механосенсорных P-клеток и связана со многими двигательными нейронами с помощью выпрямляющего электрического соединения. Было показано, что эта клетка обрабатывает сенсорные сигналы скорее во временной, чем в амплитудной области (Marín-Burgin and Szczupak, 2000). Как сообщалось в нашем предыдущем исследовании (Kretzberg et al., 2016), клетки 159 и 162 также являются интернейронами со сложными временными паттернами реакции, и было предложено выполнять временную обработку информации, например, как детекторы совпадений.К сожалению, низкое отношение сигнал / шум наших сигналов VSD не позволило детально проанализировать временную структуру ответов. Следовательно, необходимы дальнейшие эксперименты с комбинированными внутриклеточными записями и записями VSD, чтобы выявить роли этих типов интернейронов в локальной сети изгиба пиявки.
Наши результаты показывают, что даже одна стимуляция Р-клеток активирует несколько локальных интернейронов изгиба, что согласуется с предыдущими исследованиями (Baljon and Wagenaar, 2015; Frady et al., 2016). Однако сенсорные стимулы вызывали гораздо более выраженную сетевую активность, чем одиночная стимуляция Р-клеток, с точки зрения количества активированных интернейронов, продолжительности временной сетевой динамики и различных эффектов увеличения интенсивности стимула на ответы отдельных клеток.
В совокупности наши результаты подтверждают утверждение (Kretzberg et al., 2016) о том, что тактильная обработка в локальной сети изгиба является более сложной, чем простая трехуровневая сеть с прямой связью, предложенная ранее (Kristan et al., 2005). Длительные реакции на сенсорные стимулы могут быть связаны с вовлечением медленных синаптических компонентов, которые были обнаружены у моллюсков (Snow, 1982; Lieb and Frost, 1997). Поздняя активация некоторых нейронов, отвечающих только примерно через 100 мс на начало стимула, указывает на присутствие полисинаптических связей в локальной сети изгиба (Baljon and Wagenaar, 2015). Согласованные по времени входы от популяции механорецепторов, представляющих естественные сенсорные стимулы, могут вызывать нелинейную временную интеграцию и активность обратной связи в некоторых ответах интернейронов (Kretzberg et al., 2016).
В более широком плане эти эксперименты с нервной системой пиявки демонстрируют, что выбор адекватной сенсорной стимуляции необходим для изучения динамики нейронов в контексте естественного поведения. На основании открытия, что спайки от одной P-клетки могут запускать мышечное движение (Kristan, 1982; Zoccolan and Torre, 2002), инъекция соматического тока в одну P-клетку считается адекватным триггером для локального изгибного поведения (Baljon and Wagenaar, 2015; Frady et al., 2016; Томина и Вагенаар, 2017). Однако небольшое количество клеток и относительно легкий доступ к нервной системе пиявки позволили нам проверить – и опровергнуть – это предположение экспериментально в этом исследовании. Эти результаты показывают, что экспериментаторы должны использовать естественную стимуляцию органов чувств, чтобы делать выводы о поведенческой обработке нейронной информации – вывод, который актуален далеко за пределами конкретного случая механорецепции пиявки. Тем не менее, поведенческое значение сенсорной стимуляции также является спорным в этом исследовании.В природе пиявка вряд ли столкнется с ситуацией, когда небольшой предмет внезапно давит на кожу, оказывает постоянное давление в течение 200 мс и снова внезапно исчезает. Вместо этого движения тела во время необузданного поведения в естественной среде вызывают сложные паттерны активации всех типов механорецепторов (Carlton and McVean, 1995). Следовательно, необходимы дальнейшие исследования с более сложной, более естественной сенсорной стимуляцией – и выполнимые для небольшой нервной системы пиявки – чтобы улучшить наше понимание обработки сенсорной информации.
Все авторы участвовали в планировании исследования, написании рукописи и дизайне рисунков. Кроме того, EF и JK проанализировали данные, EF записал данные и составил текст, а GH провел эксперименты с VSD.
Финансирование было предоставлено стипендиатом Немецкой службы академических обменов (EF).
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Мы благодарим Фридерис Пиршель за обучение подготовке кожи пиявки и Даниэля Вагенаара за то, что он поделился своими планами строительства и программным обеспечением для установки VSD, а также Эвана Миллера за предоставленный краситель. Спасибо Го Ашиде за языковые исправления и всем членам группы вычислительной нейробиологии за критическое чтение рукописи.
Бака, С. М. (2005). Распознавание местоположения и интенсивности в реакции локального изгиба пиявки количественно определено с помощью анализа оптического потока и основных компонентов. Дж. Нейрофизиол . 93, 3560–3572. DOI: 10.1152 / jn.01263.2004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бака, С. М., Марин-Бургин, А., Вагенаар, Д. А., и Кристан, В. Б. (2008). Широко распространенное торможение, пропорциональное возбуждению, контролирует усиление поведенческой цепи пиявки. Нейрон 57, 276–289. DOI: 10.1016 / j.neuron.2007.11.028
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Блэкшоу, С.Э., Николлс, Дж.Г., и Парнас И. (1982). Расширенные рецептивные поля кожных механорецепторных клеток после делеции одного нейрона в центральной нервной системе пиявки. J. Physiol. 326, 261–268. DOI: 10.1113 / jphysiol.1982.sp014190
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бриггман, К. Л., и Кристан, В. Б. (2006). Визуализация специализированных и многофункциональных нейронных цепей, генерирующих различные модели поведения. J. Neurosci. 26, 10925–10933. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3265-06.2006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карлтон, Т., и Маквин, А. (1995). Роль прикосновения, давления и ноцицептивных механорецепторов пиявки в необузданном поведении. J. Comp. Physiol. Нейроэтол. Sens. Neural Behav. Physiol. 177, 781–791. DOI: 10.1007 / BF00187637
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фан, Р. Дж., Марин-Бургин, А., Френч, К. А., и Отто Фризен, В. (2005). Смесь красителей (нейробиотин и Alexa 488) выявляет обширное связывание красителя между нейронами у пиявок; физиология подтверждает связи. J. Comp. Physiol. Нейроэтол. Sens. Neural Behav. Physiol. 191, 1157–1171. DOI: 10.1007 / s00359-005-0047-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фатиазар Э., Анемюллер Дж. И Крецберг Дж. (2016). «Статистическая идентификация активируемых стимулом сетевых узлов в многонейронных оптических записях чувствительных к напряжению красителей», в Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2016 IEEE 38th Annual International Conference of the (IEEE), 3899–3903.Доступно в Интернете по адресу: http://ieeexplore.ieee.org/abstract/document/7591580/ (по состоянию на 30 мая 2017 г.).
PubMed Аннотация | Google Scholar
Фатиазар, Э., Крецберг, Дж. (2015). «Оценка нейрональной активности на основе визуализации чувствительного к напряжению красителя в движущемся препарате», Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2015 37-я ежегодная международная конференция IEEE (IEEE), 6285–6288. Доступно в Интернете по адресу: http://ieeexplore.ieee.org/abstract/document/7319829/ (по состоянию на 30 мая 2017 г.).
Google Scholar
Фрейди, Э. П., Капур, А., Хорвиц, Э. и Кристан, младший, В. Б. (2016). Масштабируемая полууправляемая функциональная нейрокартография выявляет канонические нейроны в поведенческих сетях. Neural Comput. 28, 1453–1497. DOI: 10.1162 / NECO_a_00852
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Холландер, М., Вулф, Д. А., Чикен, Э. (2013). Методы непараметрической статистики, 3-е изд. Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons.
Крецберг, Дж., Пиршель, Ф., Фатиазар, Э., и Хильген, Г. (2016). Кодирование тактильных раздражителей механорецепторами и интернейронами медицинской пиявки. Фронт. Physiol. 7: 506. DOI: 10.3389 / fphys.2016.00506
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кристан В. Б. (1982). Сенсорные и двигательные нейроны, ответственные за реакцию локального изгиба у пиявок. J. Exp. Биол. 96, 161–180.
Google Scholar
Либ, Дж.Р. и Фрост В. Н. (1997). Реалистичное моделирование рефлекторной цепи сифона аплизии: роли элементов схемы в создании выходной мощности двигателя. J. Neurophysiol. 77, 1249–1268. DOI: 10.1152 / jn.1997.77.3.1249
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Локери, С. Р., и Кристан, В. Б. (1990). Распределенная обработка сенсорной информации у пиявки. II. Выявление интернейронов, участвующих в локальном изгибном рефлексе. Дж.Neurosci. 10, 1816–1829.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Марин-Бургин А., Кристан В. Б. и Френч К. А. (2008). От синапсов к поведению: развитие сенсомоторной цепи у пиявки. Dev. Neurobiol. 68, 779–787. DOI: 10.1002 / dneu.20551
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Миллер, Э. В., Лин, Дж. Ю., Фрейди, Э. П., Стейнбах, П. А., Кристан, В. Б. Дж., И Цзян, Р. Ю. (2012). Оптический мониторинг напряжения в нейронах с помощью фотоиндуцированного переноса электронов через молекулярные провода. Proc. Natl. Акад. Sci. США 109, 2114–2119. DOI: 10.1073 / pnas.1120694109
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Милликен, Г. А., Джонсон, Д. Э. (2009). Анализ беспорядочных данных, Vol. 1, Планируемые эксперименты, 2-е изд. . Нью-Йорк, Нью-Йорк: CRC Press.
Google Scholar
Мюллер, К. Дж., И Скотт, С. А. (1981). Передача по «прямому» электрическому соединению, опосредованному интернейроном пиявки. Дж.Physiol. 311, 565–583.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Николлс, Дж. Г., и Бейлор, Д. А. (1968). Специфические модальности и рецептивные поля сенсорных нейронов в ЦНС пиявки. J. Neurophysiol. 31, 740–756. DOI: 10.1152 / jn.1968.31.5.740
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Николлс, Дж. Г. и Первес, Д. (1970). Моносинаптические химические и электрические связи между сенсорными и моторными клетками центральной нервной системы пиявки. J. Physiol. 209, 647–667. DOI: 10.1113 / jphysiol.1970.sp009184
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пиршель, Ф., Хильген, Г., и Крецберг, Дж. (2018). Влияние местоположения и интенсивности прикосновения на интернейроны локальной сети перегиба пиявки. Sci. Отчет 8: 3046. DOI: 10.1038 / s41598-018-21272-6
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пиршель, Ф., Крецберг, Дж. (2016). Мультиплексное популяционное кодирование свойств стимула механосенсорными клетками пиявки. J. Neurosci. 36, 3636–3647. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1753-15.2016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Томина Ю., Вагенаар Д. А. (2017). Двусторонний микроскоп для получения изображения мембранного потенциала целого ганглия у медицинской пиявки. Элиф 6: e29839. DOI: 10.7554 / eLife.29839
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Региональная договоренность о службе радиосвязи на внутренних водных путях (RAINWAT) Сергей Царнаклийский Дунайская комиссия, Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Региональное соглашение о службе радиосвязи на внутренних водных путях было подписано в Бухаресте 18 апреля 2012 года.Он был заключен между 17 администрациями Австрии, Бельгии, Болгарии, Хорватии, Чешской Республики, Франции, Германии, Венгрии, Люксембурга, Молдовы, Черногории, Нидерландов, Польши, Румынии, Сербии, Словацкой Республики и Швейцарии. Соглашение заменяет собой Региональное соглашение о радиотелефонной связи на внутренних водных путях, заключенное в Базеле 6 апреля 2000 года. Семинар 2013 года «Процветание будущего судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Соглашение было заключено с целью реализации общих принципов и правил безопасности для людей и грузов на внутренних водных путях, признавая, что гармонизация службы радиосвязи будет: способствовать более безопасной навигации, способствовать более эффективному и действенному использованию радиочастотного спектра, способствовать более эффективному , экономичное и бесперебойное выполнение управления судном. Семинар 2013 г. – процветающее будущее судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Соглашение, регулирующее услуги радиосвязи для внутренних водных путей на территории подписавших его государств, заключено в соответствии со статьей 6 Регламента радиосвязи Международного союза электросвязи (МСЭ).Структура Соглашения Соглашение состоит из 4 глав и 7 приложений. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава I – Терминология В этой главе содержатся определения некоторых терминов, используемых в тексте Соглашения, и ссылки на определения, принятые МСЭ. Ниже приводится краткое описание основных терминов. 1. Радиотелефонная служба и система автоматической идентификации передатчика (ATIS) Радиотелефонная служба на внутренних водных путях позволяет устанавливать радиосвязь для конкретных целей с использованием согласованных каналов и согласованных рабочих процедур (категорий услуг) с использованием ATIS. .Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Категории услуг на внутренних водных путях: Радиосвязь между судами между судовыми станциями. Морская информация Радиосвязь между судовыми станциями и станциями компетентных органов для эксплуатационных служб на внутренних водных путях. Станции вышеупомянутых органов могут быть как наземными, так и мобильными. Администрация судов в порту. Радиосвязь между судовыми станциями и станциями компетентных органов для оперативных служб во внутренних портах.Станции вышеупомянутых властей должны быть предпочтительно наземными станциями. Бортовая связь Внутренняя радиосвязь на борту судна или радиосвязь в группе буксируемых или толкаемых судов, а также инструкции по обращению с линией и швартовке. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
2. Радар является частью радионавигационной службы, предназначенной для использования на судах и для их безопасной эксплуатации 3.Автоматическая идентификационная система для внутреннего судоходства (АИС) АИС для внутреннего судоходства позволяет создавать системы отслеживания и отслеживания судов для конкретных целей с использованием согласованных каналов и согласованной оперативной процедуры. 4. Идентификатор морской подвижной службы (MMSI) MMSI является обязательным для использования AIS для внутреннего судоходства. Для судов, посещающих внутренние водные пути, подпадающие под действие положений настоящего Соглашения, требуется MMSI для генерации их индивидуального кода ATIS. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
5.Административные контактные лица Лица, назначаемые контрактными администрациями по всем вопросам, касающимся службы радиосвязи на внутренних водных путях. 6. База данных по идентификации судов. Контактные лица. Лица, назначенные контрактными администрациями, компетентные по всем вопросам, касающимся идентификации судов, находящихся под их юрисдикцией. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава II – Общие положения для работы службы В этой главе содержатся положения, относящиеся к: Административным положениям для судовых станций (более подробно подробно описано в Приложении 1 «Административные положения для судовых станций»). Использование частот (более подробно описано в Приложении 2 «Таблицы каналы, частоты передачи и категории обслуживания для внутренних водных путей ») Семинар 2013 г.« Процветание будущего судоходства по Дунаю »Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава II – Общие положения для работы службы (продолжение) Эксплуатационные требования и технические требования к радиооборудованию на борту судов (более подробно подробно описано в Приложении 3 «Эксплуатационные и технические требования к оборудованию») Рабочие процедуры (более подробно в Приложении 4 «Положения, касающиеся рабочих процедур») Семинар 2013 г. «Успешное будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава III – Применение Соглашения В этой главе содержатся положения, касающиеся: Административного управления Организацией и компетенцией Комитета RAINWAT (регулирует создание, состав и функции Комитета RAINWAT, основной задачей которого является администрирование, гармонизация и оптимизация Согласие, поддерживать веб-сайт.Правила процедуры Комитета приведены в Приложении 7) Семинар 2013 г. «Успешное будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава III – Применение Соглашения (продолжение) Выполнение Соглашения (относится к обязательствам администраций по принятию и применению положений Соглашения, его Приложений и Резолюций и, насколько это возможно, его Рекомендаций) Присоединение к Соглашение (содержит правила и процедуры для присоединения администраций, не подписавших Соглашение) Семинар 2013 г. «Процветание будущего судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава III – Применение Соглашения (продолжение) Денонсация Соглашения (содержит правила и процедуры для денонсации Соглашения администрациями) Координация частотных присвоений (присвоение и согласование частот должно осуществляться в соответствии с соглашением HCM или Рекомендация T / R 25 08 СЕПТ или двусторонних или многосторонних соглашений) Семинар 2013 г. «Процветание будущего судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Глава III – Применение Соглашения (продолжение) Уведомление об этом Соглашении в МСЭ и информация других организаций (требуется положениями Статьи 6 Регламента радиосвязи МСЭ.Информация, которая должна быть предоставлена о заключении, содержании и сторонах Соглашения) Глава IV – Заключительные положения Регулирует дату вступления в силу Соглашения (18 апреля 2012 г.) и признание недействительным Базельского соглашения от 6 апреля 2000 г. Семинар 2013 г. a процветающее будущее судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение I – административные положения для судовых станций Содержит положения и требования, касающиеся: Обязательного лицензирования судовой станции (SSL) Квалификации и сертификации оператора судовой станции Документы судовой станции Осмотр судовой станции компетентными органами, выдающими SSL, и государства, которые посещает корабль (в т.корректирующие меры и обязательные уведомления) Семинар 2013 г. «Процветание будущего судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение I – Административные положения для судовых станций (продолжение) Идентификация судовой станции (позывной, официальное название судна, код ATIS и, при наличии оборудования AIS, MMSI). Официальное название судна должно использоваться в категориях обслуживания: судно к судну, судно навигационной информации для портовых властей. Структура семинара ATIS Code Workshop 2013: процветающее будущее судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 1 – Административные положения для судовых станций (продолжение) ОБЯЗАТЕЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ATIS ДЛЯ ВСЕХ СУДОВ, ПОСЕТИВАЮЩИХ ВНУТРЕННИЕ ВОДНЫЕ ПУТИ, ОХВАТЫВАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯМИ ДОГОВОРА. Код ATIS.ПРИМЕЧАНИЕ: Приложения 2 и 3 не рассматриваются из-за их очень технического характера. Семинар 2013 г. – процветающее будущее судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 4 – Положения, касающиеся рабочих процедур Общая процедура радиотелефонной связи для морской подвижной службы, предусмотренная в Регламенте радиосвязи (статья 57), применяется к радиотелефонной связи и тестовым передачам радиотелефонной службы на внутренних водных путях. Специальные положения: прием сообщений. обязан подтвердить получение послания, адресованного им. Семинар 2013 г. «Процветание будущего судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 4 – Положения, касающиеся рабочих процедур (продолжение) Языки, используемые при обмене сообщениями между судном и наземной станцией, язык страны, на которой расположена наземная станция; между судовыми станциями на языке страны, в которой плавают суда, или в соответствии с требованиями Полицейских правил навигации. После 1 февраля 2022 года в основном английский язык для категорий обслуживания отправление к портовым властям и от корабля к кораблю для навигационных целей. Семинар 2013 г. – процветающее будущее для Дуная. навигация Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 4 – Положения, касающиеся рабочих процедур (продолжение) Содержание сообщения В категориях обслуживания судно-судно, навигационная информация и судно-портовым властям передача сообщений касается исключительно безопасности человеческой жизни, передвижения и безопасности. кораблей, за исключением каналов между кораблями и кораблями, специально определенных для использования для связи с социальным характером.Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 5 – Положения о приобретении, выдаче и взаимном признании свидетельств радиооператора Процедура выдачи свидетельства радиооператора: Минимальные знания, которые необходимо продемонстрировать на экзамене (Рекомендация № 3) о: положениях, касающихся радиотелефонной службы на внутренних водных путях ; работа УКВ станции; процедуры радиосвязи для обеспечения безопасности судоходства на внутренних водных путях; передача и прием сообщений; Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 6 – База данных по идентификации судов Создана база данных по идентификации судов, содержащая все позывные, официальные названия судов, коды ATIS и MMSI сторон, подписавших Соглашение.Используя позывной или официальное название судна, код ATIS или MMSI, можно получить дополнительную информацию о соответствующем судне внутреннего плавания. Базу данных и поисковую систему можно найти на веб-сайте Комитета RAINWAT, специально предназначенном для этой цели. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 6 – База данных по идентификации судов (продолжение) Все контрактные администрации направляют в электронном виде свою последнюю базу данных веб-мастеру в течение первых 5 рабочих дней каждого месяца.Между 6 и 10 рабочими днями каждого месяца веб-мастер обновляет базу данных. База данных по опознаванию судов доступна только с помощью имени пользователя и пароля. Семинар 2013: процветающее будущее для судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Приложение 7 – Правила процедуры В Приложении содержатся правила процедур, касающиеся: Пересмотра договоренности Назначение председателя и заместителя председателя Комитета по административным вопросам Веб-сайт RAINWAT Семинар 2013 года «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Кроме того, Комитет RAINWAT принял 2 Резолюции и 3 Рекомендации, касающиеся выполнения Соглашения.Резолюция № 1 постановляет, что: Центральная комиссия судоходства по Рейну (ЦКСР) и Дунайская комиссия (ДК) должны подготовить Руководство по радиотелефонной связи на внутренних водных путях по единой модели и опубликовать его; Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Постановление № 1 (продолжение): компетентные администрации должны представить ЦКСР и ДК необходимые вклады и дополнения к Руководству, касающиеся радиотелефонной службы на внутренних водных путях; Администрации должны предпринять необходимые шаги, чтобы Руководство носило на борту судов; Договаривающиеся администрации должны публиковать информацию, дополняющую Руководство, относительно радиотелефонной службы на внутренних водных путях в соответствующей форме.Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Резолюция № 2 Взаимное признание одобрений типа радиооборудования, охватываемого настоящим Соглашением В соответствии с Резолюцией Администрации должны взаимно признавать свои признанные или одобренные типы оборудования, если эксплуатационные и технические характеристики соответствующего оборудования соответствуют настоящему Соглашению или установление международно применимых стандартов Семинар 2013 года: процветающее будущее судоходства по Дунаю Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Рекомендации: Рекомендация № 1 призывает к сокращению национальных исключений; Рекомендация № 2 предлагает контрактным администрациям: предоставлять и способствовать обмену информацией о судах внутреннего плавания, на которые распространяется Региональное соглашение; поддерживать разработку общей онлайновой базы данных для судов внутреннего плавания, содержащей названия судов, код ATIS и MMSI.Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Рекомендации (продолжение): Рекомендация № 3 содержит согласованную программу экзаменов для сертификатов радистов радиотелефонной службы на внутренних водных путях и рекомендует администрациям выдавать сертификаты оператора радиотелефонной службы на внутренних водных путях кандидатам, успешно сдавшим экзамены. экзамен по программе. Семинар 2013 «Процветающее будущее судоходства по Дунаю» Будапешт, 17 сентября 2013 г.
Спасибо за внимание! Сергей ЦАРНАКЛИЙСКИЙ Советник по техническим вопросам Секретариата Дунайской комиссии сергей.